초록 ▼

○ 연구결과
• 비식용 및 비사료용 섬유질계 형질전환 에너지 작물 개발
- 국내에서 자생하는 비식용 및 비사료용 섬유질계 에너지 작물 선별 후, 참억새 8종, 물억새 7종, Miscanthus giganteus, 갈대 4종의 유전자원 수집 및 유지‧관리
- 참억새와 갈대의 미성숙 화기 이용 캘러스 유도와 식물체 재생을 위한 최적 시스템 개발
- 참억새는 95.8%의 캘러스 유도율과 58.3%의 신초 재생 효율을, 갈대는 99.9%의 캘러스 유도율과 100%의 식물체 재생 효율 확보
- 참억새와 갈대의 Ag

○ 연구결과
• 비식용 및 비사료용 섬유질계 형질전환 에너지 작물 개발
- 국내에서 자생하는 비식용 및 비사료용 섬유질계 에너지 작물 선별 후, 참억새 8종, 물억새 7종, Miscanthus giganteus, 갈대 4종의 유전자원 수집 및 유지‧관리
- 참억새와 갈대의 미성숙 화기 이용 캘러스 유도와 식물체 재생을 위한 최적 시스템 개발
- 참억새는 95.8%의 캘러스 유도율과 58.3%의 신초 재생 효율을, 갈대는 99.9%의 캘러스 유도율과 100%의 식물체 재생 효율 확보
- 참억새와 갈대의 Agrobacterium 매개 형질전환을 통하여 참억새 9계통, 갈대 8계통의 gfp 도입형질전환체를 생산 및 PCR과 GFP 발현 검정을 통한 안정적인 형질전환 확인
- 건조스트레스 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 gfp 유전자 도입 형질전환 식물체 개발
- 갈대의 rab21-gfp construct 도입 형질전환 식물체 40계통 생산 및 PCR과 건조처리 후 GFP 발현 검정으로 36계통에서 유전자의 안정적인 도입과 발현을 확인
- Cellulose 자가분해 유전자 도입 형질전환 및 선발 과정을 통하여 참억새와 갈대에서 형질전환 캘러스 확보 후, 형질전환 식물체 재생을 진행 중. 형질전환 식물체 확보 후, 특성 검정을 실시할 예정
• 셀룰로즈 분해능이 도입된 바이오에너지 모델작물 개발
- 벼로부터 건조유도성 프로모터 7종, 조직특이성 프로모터 6종, 항시발현 프로모터 3종 및 건조 유도성 유전자 3종을 분리
- 효모와 박테리아 유래의 셀룰라제 유전자 cel2 (exo-glucanase), cel4 (endo-glucanase), β-glu (β-glucosidase)를 단일 혹은 복합으로 벼 게놈에 도입한 형질전환체 및 프로모터::gfp 형질전환체 36종을 생산
- 벼에서 셀룰라제 유전자를 발현하기 위한 프로모터로는 항시발현용 프로모터 옥수수 유래 maize Ubiqutine와 벼로부터 분리한 972, 996 건조스트레스 유도성 프로모터를 사용하였으며 발현된 셀룰라제를 Apoplast로 집적
- 셀룰라제 유전자가 항시 발현되는 벼 중 일부는 성장 속도가 대조구에 비해 느렸으나, 유도성 프로모터로 발현시킨 경우는 정상적임. 형질전환 벼의 세포벽의 구조가 치밀하지 못하였으며, 당화율이 대조구 대비 두 배 이상 증가됨.
- 형질전환 벼를 곰팡이와 함께 고상발효를 한 경우 셀룰라제 생산율이 대조구에 비해 2배 이상 효율을 보임을 확인. 따라서 셀룰라제 유전자를 벼에서 발현하므로써 당화에 사용되는 효소 사용량을 감소하고 동시에 전처리 공정이 용이한 바이오매스로서의 활용 가능성을 확인함
• 바이오매스 당화효소 저가생산기술 개발
- 신규 셀룰레이즈 유전자 뿐 아니라 논문 분석과 data base 검색을 통하여 재조합 발현을 위한 후보 유전자를 선별
- 각각의 균주에서 만든 cDNA library로 부터 직접 셀룰레이즈 유전자를 증폭하거나 합성하는 방법으로 exo type 분해 효소 유전자 12 종, endo type 분해 효소 유전자 11종, 헤미셀루로즈 분해 효소 유전자 5종, β-glucosidase 유전자 5종, 기타효소 2종을 확보하여 directed - 효모를 이용한 효소의 재조합 대량생산을 위해 효모 TFP 기술을 이용하여 각 셀룰라제에 대한 고분비 생산균주(1~5 g/L 수준)를 선별함
- 선별된 생산균주를 5L 발효조를 이용하여 유가식 발효 배양을 셀룰레이즈를 최적 생산할 수 있는 기술을 개발하고 효모에서 생산된 4가지 핵심효소인 exoglucanase (CBH1,2), endoglucanase (EGL) 및 β-glucosidase (BGL)를 이용하여 다수의 KRIBB Cellulase Cocktail(KCC)을 제작하여 다양한 기질(Filter paper, Avicel, EFB, 볏짚)을 활용하여 효소 활성을 비교하고 바이오매스별 최적의 효소칵테일을 확인
- 전처리된 볏짚, 억새를 사용하여 재조합 균주를 사용한 생물통합에탄올 발효(consolidated bioprocessing)에서 외부 효소의 사용량을 50% 이상 절감하여 바이오에탄올의 생산 가능성이 확인

Abstract ▼

IV. Results of the research and development
1. Transformation system development for non-food and non-feed bioenegy crops Genetic resources of bioenergy crops, including Miscanthu sinensis, M. sacchariflorus,M. × giganteu and Phragmites communis were collected from native habitats except M. gigan

IV. Results of the research and development
1. Transformation system development for non-food and non-feed bioenegy crops Genetic resources of bioenergy crops, including Miscanthu sinensis, M. sacchariflorus,M. × giganteu and Phragmites communis were collected from native habitats except M. giganteus provided by Dongbu Farm Hannong Co. Ltd. and totally 20 genotypes of bioenergy crops were maintained in Sangmyung Univ.
Plant regeneration system were developed through the optimization of medium composition and plant growth regulator concentration using mature seeds of M. sinensis and P. communis. Also highly efficient plant regeneration system using immature inflorescences of M. sinensis and P. communis were established; 95.8% callus induction rate and 58.3 shoot induction rate in M. sinensis and 99.9% callus induction rate and 100% plant regeneration rate in P. communis were obtained.
Through Agrobacterium-mediated transformation, 9 transgenic lines in M. sinensis and 8 transgenic lines in P. communis were produced and the stable incorporation of trans gene were identified with PCR and GFP expression analysis.
Then, 40 lines of transgenic plants containing gfp gene under the control of drought stress inducible rab21 promoter were developed and the stable gene insertion and expression were confirmed using PCR and GFP fluorescence analysis.
Transgenic plant tissues containing four cellulose autolysis gene constructs with cellulase or beta-glucanase gene were obtained through Agrobacterium-mediated transformation in M. sinensis and P. communis. The transgenic tissues were used for the production of transgenic plants. After transgenic plant production, the molecular and physiochemical analysis will be conducted.
2. Development and commercialization of model plants expressing cellulases Seven drought inducible promoters, 6 tissue-specific promoters and 3 drought inducible genes were isolated from rice. A total of 36 transgenic rice plants that expressed cel2 (exo-glucanase), cel4 (endo-glucanase), β-glu (β-glucosidase) originated from yeast and bacteria in a single or multiple and promoter::gfp were constructed. The expression of cellulases in rice was driven by either the maize Ubiquitine contitutive promoter or drought inducible promoters, 972 and 996, with the signal peptide for targeting the cellulase to the apoplastic compartment for storage.
Some transgenic nce retardation, however its storage. plants contitutively expressmg cellulase exhibited growth phenotype was eliminated by use of inducible promoters. Transgenic plants showed an altered cell wall structure. A saccharification rate of transgenic rice straw was two fold higher than that of control plant. Solid state fermentation of transgenic nce straw with fungus resulted in two fold higher in cellulase production compared with that of control plant. These results indicated that transgenic plants expressing cellulase could be useful for bioethanol production by reducing the costs of cellulase as well as pretretment process.
3. Cost-effective production technology of biomass saccharification enzymes For the production of recombinant cellulase using yeast Saccharomyces cereVlsrae, numerous fungal cellulase genes were cloned from several novel and known fungal species. Cellulase genes were tried to improve for their activity and stability by using directed evolution and for different glycosylation patterns by using site directed mutagenesis, respectively. Improved cellulase genes were tried to overexpressed m yeast using translation fusion partner (TFP) technology for the hypersecretion of each cellulase. Finally, several yeast strains secreting different cellulases about 1-5 grams per liter were obtained. Fed batch fermentation of mixed yeasts producing different cellulases could provide recombinant cellulase cocktail showing hydrolyzing activity for various cellulosic substrate including alkali-pretreated rice straw. Demonstration of consolidated bioprocessing of cellulosic biomass to bioethanol using recombinant yeast mix developed in this research paves the way for low cost process for the production of cellulosic bioethanol.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 요 약 문 ... 5
• SUMMARY(영문요약문) ... 8
• CONTENTS(영문목차) ... 13
• 목 차 ... 15
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 17
• 제 1 절 연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 17
• 1. 연구개발 목적 ... 17
• 2. 연구개발의 필요성 ... 17
• 제 2 절 연구범위 ... 19
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 제 1 절 바이오매스기반 바이오에탄올 생산기술 ... 23
• 1. 세계 바이오에탄올 생산연구 동향 ... 23
• 2. 섬유질계 바이오매스 전처리 기술 ... 24
• 3. 효소당화 및 Sugar platform 구축기술 ... 24
• 제 2 절 바이오에너지 작물 형질전환 기술 ... 25
• 1. 바이오매스 작물 억새와 갈대의 대량 생산 ... 25
• 2. 억새와 갈대의 품종개발 ... 26
• 3. 비식용 및 비사료용 바이오에너지작물의 형질전환 기술 ... 26
• 제 3 절 식물체내 셀룰라제 유전자 발현 조절기술 ... 27
• 1. 셀룰라제 발현 식물체 생산 ... 27
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
• 제 1 절 바이오에너지용 비식용 및 비사료 작물 형질전환 시스템 개발 ... 29
• 1. 섬유질계 에너지 작물 수집 및 유지·관리 ... 29
• 2. 식물체 재생 시스템 확립 ... 31
• 3. Agrobacterium 매개 형질전환을 통한 모델 시스템 개발 ... 54
• 4. 유도성 프로모터 비교를 위한 Agrobacterium 매개 형질전환 ... 72
• 5. 셀룰라제 유전자 도입 Agrobacterium 매개 형질전환 ... 79
• 제 2 절 셀룰로즈 분해능이 도입된 바이오에너지 모델작물 개발 및 실용화 ... 82
• 1. 셀룰라제 유전자 발현을 위한 최적 프로모터 발굴 ... 82
• 2. 벼 유래 건조스트레스 프로모터가 도입된 형질전환 벼 제작 ... 86
• 3. 벼 유래 조직 및 발달 특이적 프로모터가 도입된 형질전환 벼 제작 ... 90
• 4. 셀룰라제 유전자가 도입된 모델작물 벼 제작 ... 92
• 5. 셀룰라제 유전자가 도입된 형질전환 벼의 구조적 특성 분석 ... 100
• 6. 벼, 억새, 갈대의 화학적 분석 ... 109
• 7. 단일/복합 셀룰라제 유전자 도입 형질전환 벼의 전처리와 효소 당화 ... 118
• 8. 바이오매스 생산 단지 조성 ... 130
• 제 3 절 바이오매스 당화효소 저가생산기술 개발 ... 134
• 1. 셀룰로즈 분해효소 유전자 확보 및 개량기술 개발 ... 134
• 2. 섬유소분해 신규 미생물 분리 및 동정 ... 138
• 3. 섬유소 분해효소 유전자 확보 ... 139
• 4. 고효율 cellulase 개량체 개발 ... 159
• 5. 재조합 효모 이용 섬유소 분해효소 대량생산 기술개발 ... 164
• 6. 고상발효에 의한 저가 셀룰라제 생산 ... 178
• 7. Xylose 고활용 효모 균주 개발 ... 184
• 8. 바이오매스 최적당화 효소 시스템 개발 ... 198
• 9. 셀룰라제 발현 형질전환벼의 효소 생산능 비교 ... 207
• 10. 동시당화 및 생물통합 공정 개발 ... 211
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 218
• 제 1 절 바이오에너지용 비식용 및 비사료 작물 형질전환 시스템 개발 ... 218
• 제 2 절 셀룰로즈 분해능이 도입된 바이오에너지 모델작물 개발 및 실용화 ... 219
• 제 3 절 바이오매스 당화효소 저가생산기술 개발 ... 219
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 225
• 제 1 절 연구 성과 ... 225
• 제 2 절 성과활용 계획 ... 226
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 230
• 제 7 장 연구시설?장비 현황 ... 233
• 제 8 장 참고문헌 ... 234
• 연구개발보고서 초록 ... 237
• 끝페이지 ... 239