초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1) 면역세포의 세포막 단백질 결합 특이 단클론 항체 라이브러리 구축
면역반응의 중추적인 역할을 담당하는 세포인 마크로파지의 전구세포인 RAW 세포를 동물면역을 실시한후 세포 막에서 발현되고있는 수용체 단백질과 특이적인 결합 특성을 지니고 있는 세포막 단클론 항체 라이브러리를 구축하였다. 면역전구세포 RAW세포를 이용해 시험관에서의 구축항체와의 공배양 실험을 통하여 항체의 면역세포 조절 생리적 기능 분석을 실시한 결과, 3-3 항체에의한 면역세포 분화 유도 특성 및 증식 조절 특성이 관찰되었다. 또한 신

Ⅳ. 연구개발결과
1) 면역세포의 세포막 단백질 결합 특이 단클론 항체 라이브러리 구축
면역반응의 중추적인 역할을 담당하는 세포인 마크로파지의 전구세포인 RAW 세포를 동물면역을 실시한후 세포 막에서 발현되고있는 수용체 단백질과 특이적인 결합 특성을 지니고 있는 세포막 단클론 항체 라이브러리를 구축하였다. 면역전구세포 RAW세포를 이용해 시험관에서의 구축항체와의 공배양 실험을 통하여 항체의 면역세포 조절 생리적 기능 분석을 실시한 결과, 3-3 항체에의한 면역세포 분화 유도 특성 및 증식 조절 특성이 관찰되었다. 또한 신규 면역세포 기능 조절 유전체 발굴 연구에의해서 신규 면역세포의 세포막 발현 신규 유전체 TLT-6유전자를 발굴하고 특이적 단클론 항체 제작을 통하여 발현 분석과 기능 분석을 실시한 결과, 자연면역세포의 세포증식 및 분화 조절 기능을 지니고 있다는 사실이 밝혀졌다.
또한 면역세포 기능 조절 수용체 단백질의 세포막 결합 규명을 통한 세포 기능 조절 특성 분석하여 자연면역세포포기능 조절 단백질 CD137L 결합 단백질 동정하였고 면역조절 후보물질 상호작용 검증하였으며 siRNA를 이용한 면역조절 신규유전자 세포 조절 기전 규명하였다. 면역세포 기능 조절 항체를 이용한 면역세포 분화 및 증식 조절 기전 규명 및 조절 인자발굴하여 면역세포 기능 조절성 항체 자극에 따른 세포 분화 및 증식 조절 기전 규명하였고 면역세포 기능 조절 단백질(CD137L) 결합 바이오 신약 후보 단백질의 세포 내 신호전달 기전 규명하였다. 선천성면역 활성 조절 단백질을 표적으로 한 면역제어를 통한 종양치료제 개발 연구를 위하여 Src tyrosine kinase 동정하였고 CD137L 자극에 의한 역신호 전달 시 CD137L/TMEM126A/Src tyrosine kinase 세포 내 위치 및 상호결합 특성을 규명하였다. TMEM126A shRNA을 이용한 stable cell line을 구축하여 세포내 TMEM126A의 생리적 기능 조절 기능을 밝혔다.
2) 암세포 특이적 바이오 신약 후보물질 발굴
사람 환자 유래 암 세포 특이적 단클론 항체 라이브러리 제작을 위하여 동물면역을 실시하고 구축된 항체라이브러리를 이용해 면역된 암 세포조직의 면역염색 방법을 통한 분석 결과 28개의 특이적 항체 라이브러리를 구축하였다. 난소암 암 면역 백신에 유용한 정상조직들에서 testis에서만 제한적으로 발현되고 각 종 암 조직에 발현되는 cancer/testis(CT) antigen 그룹에 속하는 4개의 유전자 AKAP3, SPANXA2, SMCP, UBQ를 발 굴 하였고 이중에서 SMCP 는난소암 세포주(4/8), 난소암 조직(6/16), 간암세포주(6/6), 폐암세주(6/10) 와 유방암 세포주(2/2)에서 발현되었고 AKAP3는 난소암 과간암에서 매우 높은 비율로 발현되는 것을 확인 하였다. 또한 난소암 환자의 혈청에서 novel CT antigen인 KP-OVA-52를 동정하였고 이 유전자는 난소암 조직에서 낮은 비율로 발현되는데 KP-OVA-52의 낮은 발현율은 methylationdmlgo 조절 되는 것을 확인하였다. cancer cell에서 cancer stem cell(CSC) 같은 population이 존재 한다는 가설이 많은 보고들로 확인되고 있다. 그러나 CSC의 표직 마크가 뚜렷하지 않아 여러 방법이 시도 되고 있다. 본 실험에서는 암 줄기세포 배양하는 특별한 배지를 사용하여 spheroid(100개-200개 세포 모여구형) 와 non-spheroid(분화 형)를 난소암 조직과 난소암 세포주(OV2774)에서 분리를 시도 하였다.spheroid cell은 암 줄기세포의 성질을 가지고 있고 각종 항암제, 방사선에 저항성 및 특이 면역 항원을 발현 하지 않은 특성을 가지고 있는 것으로 확인 하였다. micro array를 사용하여 spheroid 와 non-spheroid cell의 유전 발현 패턴을 비교분석한 결과, spheroid cell과 non-spheroid cell에서 특이적으로 과발현하는 750개 유전와 650개 유전자를 분석하여 정상세포에 매우 제한 적으로 발현 되는 6개의 유전자를 도출 하여 분석 하였다.

Abstract ▼

Since the establishment of monoclonal antibody production using hybridoma technology in the mid-1970s, there has been expansion progress and continuous technological improvement in the development of therapeutic antibodies. The initial technological breakthroughs involved reduction of immunoigenicit

Since the establishment of monoclonal antibody production using hybridoma technology in the mid-1970s, there has been expansion progress and continuous technological improvement in the development of therapeutic antibodies. The initial technological breakthroughs involved reduction of immunoigenicity and thus enabled repeated administration. The establishment of chimeric, humanized, and fully human antibodies has led to the great success of several 'second-generation' therapeutic antibodies, such as rituximab, trastuzumab, cetuximab, and bevacizumab. However, there still exists an urgent demand for improvement in the efficacy of the current antibody therapeutics, which is not yet fully satisfactory for application.
The mammalian immune system launches several types of attack against foreign infectious agents and the body's own cells, such as cancer cells. In native, the immune system undertakes to neutralize or destroy the infectous cells displaying these antigens. The most familiar of the immunological defense strategies involves the humaral immune response- the soluble antibody molecules capable of specifically recognizing and biding antigens. In addition, the cellular immune response is necessary to prevent tumorgenesis for mounting the spcific cytotoxic cells by T cells, NK cells, and LAK cells to attack other cells displaying certain antigens on their surface. To accomplish successful anti-tumor effect, the novel type of antibody against tumor cell surface tumor antigens should be developed and also novel cellular immune activator, such as IFN-gamma, IL-2, GM-CSF etc. To make these kind of novel therapeutic biodurgs, we have tried novel approches using making monoclonal antibodis libraries, which is specific on cell surface antigens derived from tumor cells and T cells involved anti-tumor immune response.
In this study, we have been new trials to make novel therapeutic monoclonal antibodies against immune cells and cancer cells surface molecules, which is useful for anti-tumor target and immune regulator. Firstly, we established the novel system to discover immune regulator molecules with making monoclonal antibodies, which could be bound cell surface receptor molecules that possessed cellular activation signalling into immune cells, through immunization of immune cells into host rat directly. From these trials, we developed novel 42 monclonal antibodies which could bound to immune cell surface receptor molecules. With same strategy, we also developed 24 novel monoclonal antibodies against cancer cells surface molecules that should be useful for anti-cancer therapeutic target.
In addition, we found novel immune activator by digital differential display system that could discover novel unigenes of mRNA expressing immune cells. we choose one novel immune regulator gene, TLT-6 which has transmembrane region and intracellular signalling region and one of triggering receptor expressed on myeloid cells(TREM) family.
The triggering receptor expressed on myeloid cells(TREM) family, which is abundantly expressed in myeloid lineage cells, has a pivotal role in innate and adaptive immune response. In our trials to discover novel genes which are involved in the differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells, we identified genes that is a new member of the triggering receptor expressed on myeloid cells (Trem) family, Trem-like 6(TLT-6) by in silico bioinformatics. Like other Trem family genes, TLT-6 has single immunoglobulin(Ig) domain in extracellular region and long cytoplasmic region containing two immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-like(ITIM) domain which can associated with SHP-2, but not with SHP-1. Interestingly, TLT-6 transcript and protein is expressed in almost hematopoietic lineage cells including hematopoietic stem/progenitor cells, monocytes, macrophages, T cells, and B cells intracellularly and cell surface. TLT-6 protein is up-regulated on surface of T cells, B cells, and macrophages by stimulation. Functional analysis showed that TLT-6 involved the proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells, but showed the anti-proliferative effects in T cells and macrophages. Our results demonstrates that TLT-6, a new Trem family molecule, is expressing in various hematopoietic lineage cells and regulate the activation and proliferation in hematopoietic progenitor cells, T cells, or macrophagess, positively or negatively.
Innate immune cells play critical roles in destroying tumor cells and virus-infected cells during both early and late immune responses. We found that ligation of CD137 ligand (4-1BB ligand), one of Tumor Necrosis Factor (TNF) family, which expressed on innate immune cells leaded to modulate innate immune responses. We also studied on reverse signal transduction pathways of CD137 ligand. Novel transmembrane protein 126A (126A) is identified as a binding parter with CD137 ligand in innate immune cells. CD137 ligand-mediated cellular responses were abrogated in TMEM126A knock-down cells, indicating TMEM126A is involved in reverse signals of CD137 ligand and has pivotal roles in modulating innate immunity.
TMEM126A appears to be a candidate for drug to modulate innate immunity.
The first aim is to identify ovarian cancer stem cell specific tumor antigens that react with serum IgG antibody from ovarian cancer patients and moclonal antibody library by SEREX and is develop a set of valid targets from the preliminary antigen panel for use in ovarian cancer vaccine and diagnosis. The second aim is to identify biomarker and to develop valid reagent in ovarian cancer stem cells by micro gene chip and proteomics technology. SEREX has proven to be a powerful method based on a spontaneous humoral immune response in cancer patients. We found four cancer/testis(CT) -like genes(AKAP3, SPANXA2, SMCP, UBQ) from moclonal antibody library by SEREX. Among four genes, SMCP were detected in ovarian cancer cell lines (4/8), ovarian cancer(6/16), liver cancer cell lines(5/9), liver cancer(11/16), and lung cancer cell lines(6/10). Also, immunoscreening of normal testis and two ovarian cancer cell line cDNA expression libraries with ovary cancer sera isolated 75 independent antigens, designated KP-OVA-1 through KP-OVA-75. Of these, RT-PCR showed KP-OVA-52 to be expressed strongly in normal testis, in ovarian cancer cell lines(3/8) and in ovarian cancer tissues(1/17). The silence expression of KP-OVA-52 in cancer cells is induced by the demethylating agent 5-aza-CdR. With regard to immunogenicity, we attempted analysis of anti-IgG antibodies against the isolated 75 using SADA. 4 (KP-OVA-25, KP-OVA-35, KP-OVA-68, and KP-OVA-73) of the 75 antigens were reacted exclusively with sera from cancer patients. However, KP-OVA-52 was reacted with 1 of 20 ovarian cancer sera. These data suggest that the KP-OVA-52 can be considered a novel CT antigen and may be useful for diagnosis and immunotherapy. We performed gene expression pattern of spheroid cells and non-spheroid cells by gene chip analysis. we analysed 750 genes and 650 genes in spheroid cell and non-spheroid cell and isolated putative six CT-like genes.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 6
• 제1장 서 론 ... 9
• 제1절 연구개발의 필요성 ... 9
• 제2절 연구개발의 목표 ... 14
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 15
• 1절 국외 항체 치료제 개발 현황 ... 15
• 제2절 국내 기술 개발 현황 ... 19
• 제 3장 연구 개발 수행 내용 및 결과 ... 21
• 제1절 항체 제작을 통한 면역세포 기능 조절 인자 발굴 ... 21
• 제2절 돼지 면역세포 기능 조절 단클론 항체 제작 및 특성 분석 ... 27
• 제3절 면역세포 기능 조절 인자 TLT-6 유전자 발굴 및 특성 분석 ... 28
• 제4절 면역세포 기능 조절 유전자 발굴과 생리 기능 조절 기전 규명 연구 ... 40
• 제5절 암 항원 유전체 발굴 연구 ... 61
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 78
• 제1절 목표대비 달성도 ... 78
• 제2절 정량적 성과 ... 80
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 81
• 제6장 중요 변동사항 ... 82
• 제7장 참고문헌 ... 83
• < 참고 1> 연차평가 지적사항 및 조치결과 ... 86