초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
◦ 세부과제명: 사슴만성소모성질병의 병리학적 특성분석 및 병원성 조사
- 병원성을 분석하기위하여 사슴프리온이 과발현된 형질전환 마우스에 8건 CWD감염뇌를 4마리씩 뇌내접종 후 분석결과 잠복기는 면역학적 검출법에 따른 변형프리온 양과 상관성 있음을 확인
- 동일 시료를 3가지 경로로 접종시 잠복기는 뇌내접종(150±12), 복강접종(186±3), 경구접종 (300±163) 순이었음
- 2001년 발생건과 2004년 발생건(unglycosylated form - high pattern)에

5. 최종 연구결과 요약
◦ 세부과제명: 사슴만성소모성질병의 병리학적 특성분석 및 병원성 조사
- 병원성을 분석하기위하여 사슴프리온이 과발현된 형질전환 마우스에 8건 CWD감염뇌를 4마리씩 뇌내접종 후 분석결과 잠복기는 면역학적 검출법에 따른 변형프리온 양과 상관성 있음을 확인
- 동일 시료를 3가지 경로로 접종시 잠복기는 뇌내접종(150±12), 복강접종(186±3), 경구접종 (300±163) 순이었음
- 2001년 발생건과 2004년 발생건(unglycosylated form - high pattern)에 대하여 엘크프리온이 과발현된 형질전환 마우스에 뇌내접종으로 1차 계대를 실시한 결과 2001년 발생건 (150±12), 2004년도 C22(170±15), C25(181±15), C27(191±3)의 잠복기를 보였고 면역학적 검출법에 따른 변형프리온 양과 상관성이 있음을 확인하였으며 분자생물학적 (molecular pattern 및 PNGase 처리후 unglycosylated form) 분석결과 큰 차이가 없었음
- 추가 순화를 위하여 2차 계대를 실시한 결과 잠복기는 2001년도(133±23), 2004년도 C22(144±7), C25(150±3), C27(167)로 감소하여 성공적으로 순화되었으며 분자생물학적으로도 큰 차이가 없었음
- 최종적으로 3차 계대를 실시한 결과 잠복기는 2001년도(128±13), 2004년도 C22(125±9), C25(129±12), C27(145±4)로 감소하여 C27을 제외하고는 모두 유사한 잠복기를 보였고 성공적으로 순화되었으며 분자생물학적으로도 큰 차이가 없었음
- 뇌조직의 공포변성 정도에 대하여 lesion profiling을 실시한 결과 2001년도 발생건과 2004년도 발생건은 1차 계대 또는 2차 계대시 또는 3차 계대시 큰 차이가 없었음
- 형질전환 마우스 장기(뇌, 비장, 악하림프절, 회장)에 4종의 프리온 특이 항체(F99, BL391, 8E63, SAF84)를 적용하여 면역조직화학염색법을 실시한 결과 BL391은 표준항체인 F99와 비교하여 뇌, 비장, 회장은 유사한 정도의 반응성을, 악하림프절의 경우 반응분포와 강도가 가장 좋은 결과를 확인하였으며 상용화된 SAF84는 뇌만 유사한 정도의 반응성을 보임 또 다른 개발항체인 8E63은 F99와 비교하여 뇌, 비장, 악하림프절은 유사한 정도의 반응성을, 회장의 경우 반응분포와 강도가 가장 좋은 결과를 확인함
- Astrocytosis분석을 위하여 임상증상을 발현한 형질전환 마우스 뇌조직에 면역조직화학염색법을 실시한 결과 엘크 CWD에서 보고된 바와 같이 거의 나타나지 않음을 확인함
- 2001년도 발생건을 뇌내접종한 후 일자별로(5일, 10일, 30일, 60일, 75일, 90일, 115일, 120일, 150일) 죽인 형질전환 마우스에 대하여 주요장기별 IHC 그리고 PMCA를 적용한 결과, 임상증상이 모두 나타나는 150일 이전 60일부터 PMCA 결과 뇌조직이 양성임을 확인하였고, 변형 프리온의 축적에 따라 astrocytosis가 급격히 감소하고 microglial cell이 급격히 증가함을 확인함
- 마우스 순화스트레인을 확보하기위하여 국내 발생 CWD의 뇌를 VM 마우스에 1차 접종된 뇌를 동일마우스에 2차로 뇌내접종하였으며, 1차 접종된 뇌의 전파여부를 확인하기 위한 형질전환 마우스 접종 실험 결과 형질전환 마우스 1마리에서 CWD가 증폭되었음을 확인하여 동일 접종원을 접종한 2차 계대 VM 마우스의 뇌를 3차 계대중에 있음
- 추가적으로 뇌내접종으로 1차 계대한 VM 마우스 1마리에서 CWD가 증폭되었음을 확인하여 2차 계대중에 있음
- 2001년 발생 건(pooling)에 대하여 형질전환 마우스를 이용한 end point titration을 적용한 결과 최종 감염역가는 10^5.6 mouse ic LD₅₀/g of elk brain였고 2004년도 발생건 2건 (F04C068 및 78)에 대하여도 현재 end point titration이 진행 중에 있음
ｏ 세부과제명: 국내발생 사슴만성소모성질병의 종간전파에 관한연구
- 여러 가축 및 실험동물의 PrP^c를 이용하여 PMCA를 적용한 결과 PrP^c와 PrP^SC이 동종인 경우 증폭이 가능하였으나 동종이 아닐 경우 다른 양상을 나타냄을 확인함
- 사슴프리온이 과발현된 형질전환 마우스에 소 BSE와 마우스 순화 BSE, Scrapie 스트레인에 대해 뇌내접종한 결과 소 BSE는 전파가 잘 이루어지지 않았으며 다른 스트레인은 감염은 가능한 것으로 확인됨
◦ 세부과제명: 불활화처리에 따른 CWD 물리․화학적 특성 조사
- 같은 반응성을 확인하기 위하여 마우스 BSE, 엘크 CWD, Tg CWD를 PMCA기법을 이용하여 증폭하였음
- 기존 불활화 방법으로 불활화한 경우 ELISA 및 WB결과 검출이 확인되지 않았으며, PMCA방법으로도 증폭되지 않음을 확인하였음
- 일반적인 불활화방법인 121℃ 20분의 경우 WB 결과 밴드가 희미하였으나, PMCA방법으로 증폭이 가능함을 확인하였음
- 온도별(20∼100℃)로 처리한 10분간 처리한 결과 모두 불활화 되지 않음을 확인할 수 있었으며 온도별, 화학제별 (SDS, Gdn HCl, Gdn Thiocyanate) 처리시는 100℃, 16시간 이상 처리시 낮은 농도로도 불활화됨을 확인하였음
- 가장 저항성이 강하였던 형질전환 마우스 CWD 감염 뇌조직을 이용하여 기존의 불활화 방법으로 처리한 바 뇌 유제액과 같이 PMCA방법으로도 증폭되지 않음을 확인하였음
- NaOH와 NaClO의 경우 뇌 유제액의 경우 프리온 불활화로 알려진 농도보다 낮은 농도인 0.05N에서도 불활화처리가 가능한 것으로 확인되었으나 표면에 뿌리기만 한 경우는 전혀 불활화 되지 않음을 확인할 수 있었음. 1N NaOH로도 담그어서 소독을 한 경우 1시간 처리하여도 불활화가 가능함을 확인하였음
- 고형물을 이용한 경우 NaClO의 경우 4%원액을 이용하여야 불활화됨을 확인함
- 깔집과 일반 폐기물 심부에 변형프리온을 넣어 134℃ 30분 2회 처리하였을 경우 뇌유제액에서 모두 검출되지 않았으며 PMCA로 증폭되지 않았음을 확인하였음

Abstract ▼

Title : Strain characterization of the korean CWD cases in 2001 and 2004
Results : In the primary transmission, the incubation period for a pool of two CWD cases in 2001(n=4), C22(n=4), C25(n=4) and C27(n=4) was 150±12, 170±15, 181±15 and 191±3. They are much shortened in the secondary transmissi

Title : Strain characterization of the korean CWD cases in 2001 and 2004
Results : In the primary transmission, the incubation period for a pool of two CWD cases in 2001(n=4), C22(n=4), C25(n=4) and C27(n=4) was 150±12, 170±15, 181±15 and 191±3. They are much shortened in the secondary transmission as a pool of two CWD cases in 2001(n=3) : 133±23, C22(n=3) : 144±7, C25(n=3) : 150±3 and C27(n=3) : 167 and in the third transmission as a pool of two CWD cases in 2001(n=3) : 128±13, C22(n=4) : 125±9, C25(n=5) : 129±12 and C27(n=4) : 145±4. LaFauci et al (2006) and Tamguney et al (2009) also reported the shorter incubation period as a result of adaptation. The western blotting band patterns and the unglycosylated band after PNGase treatment are same in the original inoculums and after primary and secondary transmissions. Lesion profiling results show also similar patterns in the primary, secondary and third transmissions with the highest vacuolation scores at the “G3” and "G7" area.
Title : Protein misfolding cyclic amplification(PMCA) for assessment of CWD inactivation
Results :
After four rounds of amplification, no signals were observed in the autoclaved samples treated at temperatures at 138C. In the samples autoclaved at 121C and all dry heating samples, PrP^sc signals became obvious in the second or third round of amplification. These observations indicated that trace amounts of PrP^sc had remained after these inactivation treatments
Conclusions : PMCA technique was capable of amplifying residual PrP^sc in the infected materials after the inactivation treatments. In the amplification efficiency and the characteristics of PrP^sc amplified by PMCA must be taken in to consideration for safety evaluation of PrP^sc inactivation.

목차 Contents

• 총괄요약표 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 4
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 5
• 1. 재 료 ... 5
• 2. 연구전략 및 방법 ... 5
• III. 연구결과 ... 7
• 1. 제1세부과제명 : 사슴만성소모성질병의 병리학적 특성 분석 및 병원성 조사 ... 7
• 2. 제2세부과제명 : 국내발생 사슴만성소모성질병의 종간전파에 관한연구 ... 14
• 3. 제2세부과제명 : 불활화처리에 따른 CWD 물리․화학적 특성 조사 ... 16
• IV. 연구결과요약 ... 21
• 1. 제1세부과제명 : 사슴만성소모성질병의 병리학적 특성 분석 및 병원성 조사 ... 21
• 2. 제2세부과제명 : 불활화처리에 따른 CWD 물리․화학적 특성 조사 ... 21
• V. 고 찰 ... 22
• VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 24
• VII. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 24
• VIII. 주요연구과제 변경사항 ... 24
• IX. 참고자료 ... 25
• X. 영문초록 ... 26
• 끝페이지 ... 27