초록 ▼

1. Ino80의 염색체분리 과정에서의 역할 규명
(1) Ino80 단백질의 N-말단 및 ATPase 부분이 α-tubulin과 직접 결합함을 규명
(2) Ino80 단백질의 N-말단 및 ATPase 부분이 microtubule과 직접 결합함을 증명
(3) Ino80의 N-말단 및 ATPase 부분과 α-tubulin의 생체 내 결합 증명
(4) Ino80과 microtubule의 결합에 α-tubulin의 E-hook 부분이 중요함을 증명
(5) α-tubulin과 결합하는 Ino80 단백질의 결합 부분

1. Ino80의 염색체분리 과정에서의 역할 규명
(1) Ino80 단백질의 N-말단 및 ATPase 부분이 α-tubulin과 직접 결합함을 규명
(2) Ino80 단백질의 N-말단 및 ATPase 부분이 microtubule과 직접 결합함을 증명
(3) Ino80의 N-말단 및 ATPase 부분과 α-tubulin의 생체 내 결합 증명
(4) Ino80과 microtubule의 결합에 α-tubulin의 E-hook 부분이 중요함을 증명
(5) α-tubulin과 결합하는 Ino80 단백질의 결합 부분 결정
(6) Microtubule과 결합하는 Ino80 단백질의 결합 부분 결정
(7) Ino80가 microtubule assembly를 통하여 염색체분리에 중요한 역할을 한다는 사실을 증명
2. Knockout 마우스를 이용한 Ino80의 in vivo 기능 규명
(1) Ino80는 초기배아발생에 필수적인 유전자임을 증명
(2) Ino80는 배반포 이후 단계에서 ICM 형성과 배아줄기세포 생성에 필수적임을 발견
(3) Ino80는 초기배아세포의 DNA 복제에 필수적인 것으로 밝견. 즉, Ino80 결손 마우스는 초기 배아발생에서 DNA 복제 결함으로 인하여 ICM 형성을 못한다는 사실을 시사함
(4) Ino80는 haploinsufficient phenotype을 보인다는 사실을 확인: Ino80^+/- MEF 세포에서는 염색체 구조이상으로 보이는 centromere 가 서로 붙은 염색체를 지닌 세포를 많이 볼 수 있었으며 Ino80^+/- 배아 섬유아세포는 배양되면서 노화(senescence)현상을 벗어남. 즉, Ino80가 유전체 안정성 유지를 통해 암 발생을 억제한다는 사실을 시사함.
3. APC^min/+ 마우스 모델을 이용한 Ino80의 대장암 관련 기능 분석
(1) Ino80^+/- x APC^min/+ 교배를 통하여 Ino80 단백질양이 반으로 줄었을 때 APC^min/+ 마우스의 소장에서의 종양 발생에 미치는 영향을 분석한 결과 예상과는 반대로 종양 발생이 감소하는 결과를 얻었음. 이는 Ino80가 in vivo 에서는 유전체불안정성을 초래하여 세포사멸을 유도하는 데서 기인하는 것으로 추정됨.
(2) 이 결과를 확인하기 위하여 Ino80 haploinsufficient phenotype의 p53 의존성을 조사한 결과 예상대로 p53 결손에 의한 발암 기인 사망률을 다소 감소시키는 결과를 얻었음.
4. 암억제 인자 Bap1과 Ino80의 관련성 규명
(1) Yeast two hybrid 스크리닝을 통하여 Ino80 결합 단백질로서 Bap1 발굴하였음. Bap1은 핵에 존재하는 탈유비퀴틴화 효소로서 MPM과 같은 중피종 종양세포에서 그 유전자가 결손되어 있고 knockout 마우스 실험을 통하여 암억제인자로 증명되었음.
(2) Bap1은 탈유비퀴틴화를 통하여 Ino80를 Ino80을 안정화시키고 세포 내의 Ino80 단백질 양을 증가시킴. 또한 Bap1은 replication fork에 존재하는 ub-H2A/B 와의 결합을 통하여 Ino80를 fork에 recruit 하고 이를 통하여 DNA 복제 효율을 증가시키고 비정상적인 염색체 구조가 발생하지 않도록 도와준다는 사실을 밝혔음.
(3) MPM 유래 세포주 및 MPM 환자의 조직을 분석한 결과 Bap1이 결손된 종양세포에서 Ino80 발현양도 함께 감소한다는 중요한 사실을 발견하였음. 이 결과와 Bap1이 Ino80 안정화를 통해 유전체안정성을 유지시킨다는 사실에 근거하여 [Bap1 → Ino80 → Genome stability ⊣Tumorigenesis] 라는 새로운 암억제 경로를 제안하였음.

Abstract ▼

1. Elucidation of the role of Ino80 in chromosome segregation
(1) The N-termainal and ATPase domains of Ino80 directly interact with α-tubulin
(2) The N-termainal and ATPase domains of Ino80 directly interact with microtubule
(3) The interaction of the N-termainal and ATPase domains of Ino8

1. Elucidation of the role of Ino80 in chromosome segregation
(1) The N-termainal and ATPase domains of Ino80 directly interact with α-tubulin
(2) The N-termainal and ATPase domains of Ino80 directly interact with microtubule
(3) The interaction of the N-termainal and ATPase domains of Ino80 occur within cells
(4) The E-hook of α-tubulin is invovled in the interaction with Ino80
(5) The protein region that interacts with α-tubulin was determined
(6) The protein region that interacts with microtubule was determined
(7) The results suggest that Ino80 contributes to genome stability via its role in spindle microtubule assembly and chromosome segregation
2. Demonstration of the in vivo function of no80 using knockout mice
(1) Ino80 is essential for the early stages of mouse embryonic development
(2) Ino80 is required for the formation of inner cell mass and stem cells after blasotcyst stage
(3) Ino80 is required for efficient DNA replication during early embryogenesis
(4) Ino80 shows an haploinsufficient phenotype: Ino80^+/- MEFs show chromosomal abnormalities such as dicentric chromosome and also senescence escape when cultured in vitro, suggesting that Ino80 may function as an haploinsufficient tumor suppressor.
3. Finding the role of Ino80 in colon cancer development of APC^min/+ mice
(1) Unexpectedly, the tumors in intestine were reduced when Ino80^+/- was crossed with APC^min/+ mice as compared to APCmin/+ mice, suggesting that Ino80 may induce apoptosis of tumor cells by increasing genome instability
(2) Consistent with these results, reduction of Ino80 protein by half decreases the death rates of p53^-/- mice.
4. Ino80 is regulated by tumor suppressor Bap1
(1) We identified Bap1 as an Ino80 interacting protein by yeast two hybrid screen. Recent studies show that Bap1 (BRCA1 associated protein 1), the nuclear deubiquitinase, is novel tumor suppressor.
(2) Bap1 deubiquitinates and stabilizes Ino80 and recruit it the replication for efficient replication elongation and suppression of genome instability. The recruitment of Ino80 to the replication forks is based on the interaction between Ino80 and Bap1.
(3) Importantly, Ino80 is down regulated in the Bap1-lacking tumor cells from MPM patients. Based on these results, we propose a novel tumro suppressor pathway denoted as [Bap1 → Ino80 → Genome stability ⊣Tumorigenesis].

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목 차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• (1) 연구개발의 최종목표 ... 8
• (2) 연구배경 및 필요성 ... 8
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 12
• (1) 배경 ... 12
• (2) 세포수준에서 INO80의 유전체안정성 유지 및 암 억제 기능 분석 ... 12
• (3) INO80 마우스에 대한 암 발생 분석 ... 13
• (4) INO80 암 억제 기능과 p53과의 상관관계 분석 ... 13
• (5) INO80의 대장암 억제 기능 분석 ... 14
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 14
• 가. Ino80의 spindle assembly 및 염색체분리에서의 역할 규명 ... 14
• (나) Knockout 마우스를 이용한 Ino80의 in vivo 기능 규명 ... 24
• (다) 암억제 인자 Bap1과 Ino80의 관련성 규명 ... 36
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 39
• (가) Ino80의 spindle assembly 및 염색체분리에서의 역할 규명 ... 39
• (나) Knockout 마우스를 이용한 Ino80의 in vivo 기능 규명 ... 39
• (다) APCmin/+ 마우스 모델을 이용한 Ino80의 대장암 관련 기능 분석 ... 39
• (라) 암억제 인자 Bap1과 Ino80의 관련성 규명 ... 39
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 41
• (1) 연구성과 총괄 ... 41
• (2) 연구성과 상세내역 ... 42
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 44
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 45
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 45
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 45
• 7. 참고문헌 ... 46
• 8. 첨부서류 ... 49
• 끝페이지 ... 50