[보고서]화상의 진행 단계별 문제 해결을 위한 치료기술 개발

최인근

화상의 진행 단계별 문제 해결을 위한 치료기술 개발
Therapeutic Stratages for Overcoming Burn-related Disorders 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	한림대학교 산학협력단
연구책임자	최인근
참여연구자	서정훈 , 정제훈 , 이병철 , 안근재 , 강태천 , 김준섭 , 강윤경 , 김진나 , 김지욱 , 김유정 , 김남혜 , 성윤지 , 홍아람 , 이소현 , 양은경 , 주지훈 , 정삼현 , 윤계환 , 윤소정 , 고아라 , 박상철 , 전욱 , 박만성 , 김근형 , 최원익 , 최민경 , 정삼현 , 이형진 , 이일섭 , 이수연 , 윤현 , 원용관 , 박세희 , 박선화 , 김진일 , 김용복 , 김성포 , 고장휴 , 조용석 , 박재봉 , 김용선 , 이현주 , 최명주 , 김명주 , 이은희 , 우흥정 , 김재석 , 임동석 , 유성훈 , 이종태 , 허준 , 송원근 , 임해준 , 전상일 , 한승훈 , 김정희
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2013-04
과제시작연도	2011
주관부처	보건복지부
과제관리전문기관	한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute
등록번호	TRKO201400003869
과제고유번호	1465010348
DB 구축일자	2014-05-07
키워드	화상.후유증.피부 개발 및 이식.세포 치료.혈액투과.Burn.sequellae.artificial skin transplantation.cell therapy.vascular permeability.

초록 ▼

화상의 진행 단계별 문제 해결을 위한 치료기술을 개발하기 위하여
제1세부 화상 후유증의 심리적 재활
제2세부 돼지피부를 이용한 광범위 화상치료용 무세포진피 제조기술 개발 및 사업화
제3세부 진피대체물과 배양피부세포를 이용한 바이오인공피부 개발
제4세부 화상에 의한 생리적 기능부전 연구 및 이를 이용한 치료 후보 물질 탐색
제5세부 화상 후 내과적 급성 합병증 치료의 다섯 가지 연구를 시행하여
29편의 국외SCI(E)등재학술지 논문 등 35편의 논문 발표
5건의 국내 특허 등록
2건의 시제품

Abstract ▼

Ⅲ. Results of Research & Development
Investigation of gene change in PTSD animal model
Investigation of cord injury sequelae spinal due to electrical burn
Confirmation of plasma application effect for scar inhibition in animal scar model
Investigation of intraspinal auaporin expression change by burn electrical shock
Investigation of the role of Fractalkine/CX3CR1 system in the process of nerve cell injury
Identification of protein that is overexpressed of lost in Keloid
Establishment of long-term preservation skill for living tissue using radiation exposure
Development of selective elimination skill of immunogen in living tissue
Clinical trial of biological dressing material
Development of production method for functional scaffold
Analysis of Pseudomonas aeruginosa inhibition effect of rNDV/hBD4 virus expressing human beta-defensin 4 (hBD4) in vitro
Production of recombinant NDV virus simultaneously expressing hVEGF and hBD4 proteins
Measurement of permeability change in cultured endothelial cell
Investigation for the possibilities of proteins controlling cell permeability as medicine
Investigation of nerve cell damage mechanism due to increment of blood vessel permeability
Construct of therapeutic monitoring system for antibiotics in burn patients and antibiotic administration
Change of stress-reactive hormone after burn

목차 Contents

표지 ... 1
제출문 ... 3
보고서 요약서 ... 4
요약문 ... 5
SUMMARY ... 6
6.1 총괄연구개발과제의 연구성과 실적 및 향후 계획 ... 7
6.2 연구성과 유형별 세부 내역 ... 8
6.2.1 연구논문 ... 8
6.2.2 지적재산권 ... 9
6.2.3 제품개발 ... 11
6.2.6 기술이전 ... 13
6.2.10 기술료 징수 현황 ... 13
6.2.17 임상연구자원 확보성과 ... 13
6.2.18 임상시험실시 성과 ... 14
7. 참여연구원 현황표 ... 17
II. 총괄연구과제 연구결과 ... 19
1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ... 20
2. 국내외 기술개발 현황 ... 21
3. 연구개발과제의 추진체계 ... 25
4. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 28
5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 32
6. 향후 연구성과 추진 계획(※해당되는 경우만 작성) ... 42
7. 연구개발결과의 파급효과 ... 42
8. 연구개발결과의 활용계획 ... 46
III.제1세부과제연구결과 ... 49
1. 연구개발과제의 목표 ... 50
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 60
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 62
4. 참고문헌 ... 103
III.제2세부과제연구결과 ... 109
1. 연구개발과제의 목표 ... 110
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 113
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 115
III.제2세부과제연구결과 ... 159
1. 연구개발과제의 목표 ... 160
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 160
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 160
4. 참고문헌 ... 178
III.제3세부과제연구결과 ... 179
1. 연구개발과제의 목표 ... 180
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 196
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 198
4. 참고문헌 ... 223
III.제4세부연구과제연구결과 ... 224
1. 연구개발과제의 목표 ... 225
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 230
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 231
4. 참고문헌 ... 263
III.제5 세부과제연구결과 ... 264
1. 연구개발과제의 목표 ... 265
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 267
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 268
4. 참고문헌 ... 299
IV. 첨부서류 ... 300
국가연구시설ㆍ장비 NTIS 등록 현황 ... 301
끝페이지 ... 302

표/그림 (162)

표 Genetic candidates of Skin Contracture after Burn
표 Genetic candidates of PTSD
표 siRNA induced mRNA slicing
표 World siRNA Market Growth 2006-2015
표 Recent development of siRNA treatment.
표 The effect of ECS on PV immunoreactivity in the rat hippocampus
표 제1형 및 제2형 알코올 의존 환자의 유전자 다형성 연구 결 과
표 Fig 4. Alcohol induced variation of gene expression results from RT-PCR
표 microarrary 의 HCA 와 PCA 분석
표 Functional annotation cluster analyses
표 가장 높은 수준으로 변화한 유전자들의 qPCR 검정
표 Microarrary 결과의 IHC 검정
표 Microarrary 결과의 western blot 검정
표 전기 손상기의 개괄도
표 전기 척수신경손상 백서의 BBB scale의 변화
표 MEP 시행 모습
표 전기 척수신경손상 백서의 Manganase enhance MRI 소견의 변화
표 전기 손상 초기 척수신경의 전자현미경 사진
표 전기 척수신경손상 백서의 H&E 염색 소견
표 전기화상 후 척수신경손상 환자의 유발 전위 검사(MEP) 소견
표 F wave latency and motor evoked potential onset latencies in electrical burn induced myelopathy patients
표 전기 척수신경손상 환자의 일반 MRI소견
표 전기 척수신경손상 환자의 DTI와 DTT 소견
표 전기 척수신경손상 환자의 T2 map소견
표 Contact Burn Injury Device 2× 0.5cm의 probe를 가진 장치
표 Mechanical loading device on hypertrophic scar
표 Burn scar formation after mechanical loading
표 플라즈마 처리된 섬유아 세포에서의 apoptosis 발생 확인
표 동물모델에 적용한 플라즈마 장치 시제품
표 Changes in scar appearance over 6 weeks in the plasma and control groups from another mouse
표 Blood perfusion and wound reduction after non thermal plasma application
표 (a) Plasma induces cell death of HTSF. Cells were pretreated with or without NAC (10mM) for 30min before plasma treatment. After 24h,cells were stained with FITC- Annexin V and then checked cell death rates. Measurement was obtained as relative fluorescence units (RFU) normalized to he results shown represent the mean of triplicates of three separate experiments ± S.D., p < 0.01. (b) Plasma stimulates ROS formation in HTSF cells. Cells were treated with or without plasma and then immediately ROS generation was determined for 15 min, using a chemiluminescence assay.
표 Sequence alignments of the three human RhoGDIs
표 Expression of EK in keratinocytes (HaCaT cell lines)
표 Expression and Interaction of between RhoGTPase and RhoGDI by EK
표 Activation of RhoGTPases by EK
표 EK regulates migration of HaCaT cells via RhoGDI cleavage
표 Schematic model of signaling events of EK induced RhoGDI cleavage and RhoGTPases activation
표 Comparative analysis of 2-dimensional electrophoresis (2-DE )gel maps.
표 Differential erpression of protein spots in skin sample from subjects with hypertrophic scars
표 Serum and tissue expression of galectin-7.
표 Galectin-7 expression during the wound healing process in healthy control skin.
표 TLR4 expression in the hippocampus at 1 day after LPS injection
표 p52-Ser865, and p52-Ser869 NF-κB phosphorylation induced by LPS injection
표 p65-Ser276 NF-κB phosphorylation induced by LPS injection
표 p65-Ser311 NF-κB phosphorylation induced by LPS injection
표 p65-Ser468 NF-κB phosphorylation induced by LPS injection
표 p65-Ser529 NF-κB phosphorylation induced by LPS injection
표 p65-Ser536 NF-κB phosphorylation induced by LPS injection
표 Linear regression analysis for gamma-irradiation sensitivity of bacteria
표 Gamma-irradiation sensitivity of bacteria.
표 Linear regression analysis for gamma-irradiation sensitivity of virus
표 Porcine skins irradiated with buffer containing 20% glycerol
표 Effect of gamma-irradiation on texture of porcine skin
표 construction of skin.
표 Collagen structure.
표 Elastin structure.
표 Glycosaminoglycan structure
표 Collagen, GAG, Elastin concentrations from gamma-irradiated porcine skin
표 SDS-PAGE analysis of collagen from gamma-irradiated porcine skin
표 SDS-PAGE analysis of collagen from porcine skin after treatment of HA (0.4%)
표 SDS-PAGE analysis of collagen from porcine skin after treatment of Vitamin C (1%)
표 SDS-PAGE analysis of collagen from porcine skin after treatment of different Vitamin C concentration (0.1, 1%)
표 Vitamin C
표 Effect of gamma-irradiation on texture of porcine skin after treatment of Vitamin C (1%, Ascorbic acid)
표 Linear regression analysis for gammairradiation sensitivity of bacteria and virus after treatment of Vitamin C (1%, Ascorbic acid)
표 Histopathological analysis by HE staining of porcine skin
표 Histopathological analysis by HE staining of porcine skin
표 InsureGraf의 제조 허가증 및 공인시험기관의 생물학적안전성시험 적합 성적서
표 InsureGraf 포장외형 및 실제 제품 사진
표 장기보존안정성시험 항목, 시료량 및 시험스케쥴
표 장기보존안정성시험 시험항목 및 방법, 적합기준
표 장기보존안정성시험(36개월) 결과
표 동물 이식을 통한 lisureGraf의 타사제품 대비 동등이상 분해내성확인
표 InsureGraf 의 수화 후 사진
표 물성측정기
표 각 제품별 인장강도 측정결과(kpa)
표 Collagenase 분해도 결과
표 Trypsin 분해도 결과
표 타사제품과 InsureGraf의 trypsin 효소 분해실험
표 세포독성시험 육안관찰 및 MTT assay 결과
표 ISO 10993-5 의 세포독성의 정성적 평가 등급기준
표 Micro pig 미식1주, 3주후 H&E Staining
표 기니아픽 피하이식 2,4주 H&E Staining
표 임상시험계획서 요약
표 hBD4 를 발현하는 NDV genome 의 모식도
표 NDV 바이러스를 제작하기위한 reverse genetics system의 모식도
표 PCR 을 이용한 hBD4 유전자의 합성
표 NDV genome 내의 hBD4 유전자의 확인
표 NDV 의 P 유전자와 M 유전자 사이에 있는 hBD4 유전자의 확인
표 Hemagglutinin assay 결과
표 역유전학 방법으로 제작한 재조합 바이러스의 genome 내에 hBD4 유전자의 존재유무 확인
표 역유전학 방법으로 제작한 재조합 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이에 hBD4 유전자의 존재유무 확인
표 각 세포에서의 시간에 따른 GFP 발현율
표 GFP 발현의 현미경적 관찰
표 hBD4 단백질의 발현 여부 확인 (IFA)
표 hBD4 단백질의 발현 확인 (ELISA)
표 P. aeruginosa colony counting (in vitro)
표 화상을 입힌 뒤 1일째 사진
표 실험 후 2주 후의 사진
표 실험 후 2주 후의 사진
표 실험 후 3주 후의 사진
표 각 그룹별 마우스 화상부위에서의 P. aeruginosa colony counting
표 이전에 확인된 rNDV/hBD4에 의한 MDBK 세포주에서의 P.aeruginosa 억제 효과 확인
표 HEK 세포에서의 rNDV/hBD4에 의한 P.aeruginosa 억제 효과 확인
표 Triple hBD4 가 삽입된 NDV genome 의 모식도
표 triple hBD4 단백질을 발현하는 NDV 바이러스 단백질의 발현 여부 확인 (IFA, Texas red) - 대조군
표 rNDV/ triple hBD4 바이러스에 의한 hBD4 단백질의 발현 여부 확인 (IFA, Alexa488) - 실험군
표 hVEGF 가 삽입된 NDV genome 의 모식도
표 hVEGF 유전자와 hBD4 유전자가 동시에 삽입되어 있는 NDV genome 의 모식도
표 rNDV/hVEGF를 감염시킨 fibroblast 세포에서 발현되는 hVEGF 단백질 발현 확인 (Westen blot)
표 . NDV genome에 hVEGF 유전자와 hBD4 유전자 존재여부 확인을 위한 PCR 결과
표 hBD4 와 hVEGF 를 동시에 발현하는 NDV 바이러스의 효능평가 모식도
표 Regulation of Rho GTPase activity
표 Activation of NADPH oxidase
표 Regulation of Cell-cell interaction
표 LPS에 의해 유도되는 IL-8 promoter 활성화와 세포독성에 flavonoid들이 미치는 영향 평가
표 끓는 물로 마우스의 피부에 화상을 유발한 후, 21일 동안 flavonoid들을 처리 한 마우스의 사진(A) 과 피부 조직 H&E 염색 (B) 결과
표 끓는 물로 마우스의 피부에 화상을 유발한 후, 30일 동안 kaempferol을 매일 도포한 마우스의 사진(A) 과 피부 조직 H&E 염색 (B) 결과
표 끓는 물로 마우스의 피부에 화상을 유발한 후, 30일 동안 kaempferol을 매일 도포한 마우스의 피부조직에서 RNA를 분리하였음. 싸이토카인등의 primer를 이용하여 RT-PCR을 수행하였음.
표 인간 B 세포주인 RPMI 8226 세포에 LPS 와 CpG-DNA를 일정시간 간격으로 처리하였음
표 인간 B 세포주인 RPMI 8226 세포에 여러 종류의 CpG-DNA를 4시간 동안 처리하였음
표 인간 혈액의 PBMC를 분리하여 phosphorothioate backbone의 CpG-DNA (4531(S))를 처리하였음
표 LPS 및 CpG-DNA에 의해 유도되는 β-defensin-2 promoter 활성화
표 CpG-DNA에 의해 유도되는 β-defensin-2의 발현 기전 규명
표 TNF-α에 의해 유도되는 IL- 8 promoter 활성화와 세포독성에 flavonoid들이 미치는 영향 평가
표 끓는 물로 마우스의 피부에 화상을 유발한 후, 5일 동안 매일 LPS (5 mg/Kg), CpG-DNA (MB-ODN 4531(S)) (2.5 mg/Kg) , 또는 non-CpG-DNA 2041(S) (2.5 mg/Kg)를 도포하고 2일 후 와 9일 후에 마우스의 사진(A) 과 피부 조직을 H&E 염색 (B, C) 결과
표 Fig. 13. 끓는 물로 마우스의 피부에 화상을 유발한 후, 5일 동안 매일 LPS (5 mg/Kg), CpG-DNA (MB-ODN 4531(S)) (2.5 mg/Kg)를 도포하고 도포한 마우스의 피부조직에서 RNA를 분리하였음. 싸이토카인등의 primer를 이용하여 RT- PCR을 수행하였음
표 끓는 물로 마우스의 피부에 화상을 유발한 후, 5일 동안 매일 LPS (5 mg/Kg), CpG-DNA (MB-ODN 4531(S)) (2.5 mg/Kg) 를 도포하고 도포한 후 9일 후에 spleen, mesenteric lymph node, axillary lymph node, and inguinal lymph node 에서 면역세포의 분포 변화를 FACS 분석을 통하여 확인함
표 Increase of permeability of human vascular endothelial cells (HUVEC) by thrombin
표 Superoxide formation by thrombin in human vascular endothelial cells (HUVEC)
표 Increase of actin content by thrombin
표 Increase of RhoA expression depending on population doubling (PD) time
표 Knockdown of Rap1 by transfection of si-Rap1 into endothelial cells
표 약물 중 혈관내피세포의 투과성을 감소시키는 효과를 관찰한 결과
표 Thrombin에 의한 Rap1의 Serine 잔기의 인산화가 증가 확인한 결과
표 약활성산소가 혈관내피세포의 투과성을 증가시키는지를 관찰한 결과
표 (A) 혈관내피세포의 Rap1의 돌연변이형 (WT, Y159E 그리고 Y159F)를 트랜스펙션하고 24시간 뒤 세포를 카운팅하여 2.5 X104 개의 세포를 Permeable Kit를 배양한 뒤, 충분히 100 %까지 세포가 자라면 FITC-Dextran을 이용하여 세포의 투과성을 관찰함. (B) 293 세포에 Rap1의 돌연변이형 (WT, Y159E 그리고 Y159F)를 트랜스펙션하고 Thromibin으로 자극을 준 뒤 GTP-Rap1의 활성을 pull down assay를 진행함
표 . 젊은 혈관내피세포와 노화된 혈관내피세포의 투과성 차이
표 젊은 혈관내피세포와 노화된 혈관내피세포의 RhoA, Cdc42, Rac1, Rap1, CCN1 and β-actin을 western blot으로 확인함
표 젊은 혈관내피세포와 노화된 혈관내피세포를 60 mm dish에 배양한 후, thrombin으로 자극을 준 후, 10 μM의 hydroethidium을 넣어 10분간 배양한 후, 형광현미경으로 관찰함
표 Fig. 27. 젊은 혈관내피세포와 노화된 혈관내피세포를 100 mm dish에 배양한 후, Thrombin, LPS 그리고 TNF-α로 시간별로 자극을 준 뒤, western blot으로 p-p65, p-IκB-α, p65 그리고 I κB-α를 확인함
표 젊은 혈관내피세포와 노화된 혈관내피세포를 100 mm dish에 배양한 후, TNF-α로 자극을 준 뒤, Pull down assay로 GTP-RhoA을 관찰함
표 혈관내피세포에 HA1077, BMS345541 그리고 NAC을 전처리한 후, thrombin이나 TNF-α로 자극한 뒤, FITC-Dextran permeability를 측정함 (A 와 B)
표 (A) 마우스의 복강 내 대식세포를 분리하여 TGF-β1 5 ng/ml 을 처리한 뒤 세포의 이동성을 Transwell Permeable Kit을 이용하여 확인함. (B) Raw 264.7 세포에 MIP-1α 항체 2 μg/ml 전처리한 뒤 TGF-β1 5 ng/ml을 처리한 뒤 세포의 이동을 관찰함
표 (A) Raw 264.7 세포에 각각의 DNA 2 μg을 트랜스펙션하고 24시간 뒤 TGF-β1으로 자극한 뒤 세포의 이동성을 관찰하였음. (B) Raw 264.7 세포에 LPA 10 μM을 전처리한 뒤 TGF-β1 5 ng/ml으로 자극한 뒤 세포의 이동성을 관찰함. (C), (D) Raw 264. 7 세포에 scrambled sh-RNA와 RhoA sh-RNA를 트랜스펙션한 뒤, 72시간 뒤 serum starvation 한 뒤 TGF-β1 5 ng/ml을 처리한 뒤 세포의 이동성과 RT-PCR을 통해 MIP-1α의 발현을 관찰함
표 (A) Raw 264.7 세포에 8CPT-2Me-cAMP를 농도별로 1시간 처리한 뒤 His-RalGDS와 GST-Rhotekin으로 pull down assay를 진행함. (B) Raw 264.7 세포에 Rap1의 siRNA를 트랜스펙션한 뒤 RhoA의 활성형과 세포의 이동성을 관찰함. (C) RhoA의 DN와 CA 돌연변이형을 트랜스펙션한 뒤 Rap1의 활성형을 관찰함
표 (A) Raw 264.7 세포에 IκBα의 super repressor (S32,36A)를 트랜스펙션하고 IKK2 inhibitor의 BMS를 전처리한 뒤 TGF-β1으로 1시간 자극한 뒤, NF-κB의 promoter gene을 이용하여 luciferase assay를 진행하였음. (B),(C) Raw 264.7 세포에 IKK2 inhibitor의 BMS를 전처리한 뒤 TGF-β1으로 1시간 자극한 뒤, MIP-1α의 발현을 RT-PCR로 확인함. 또한 세포의 이동성도 관찰함
표 사람 혈액으로부터 추출한 유전자에서 10가지 인간 내인성 레트로바이러스 PCR 분석
표 사람 혈장에서 추출한 viral RNA를 이용하여 10가지 인간 내인성 레트로바이러스 RT-PCR 분석
표 The RT-PCR analysis of seven HERV transcripts in the plasma samples from patients with burns and form normal individuals
표 The prevalence of HERV transcripts amplified form the plasma of burn patients and normal individuals.
표 유효한 공변량 모델
표 Meropenem 최종 모델의 Goodness of fit graph
표 Visual predictive Check (VPC) 그래프
표 meropenem혈중농도가 MIC이상으로 유지되는 시간이 dosing interval의 40% 이하가 될 확률
표 The basic goodness-of-fit plot of the final PK model with all covariates
표 VPC results by dosing regimen
표 Probability of Target Attainment by fluconazole regimen and covariates affecting fluconazole clearance
표 유효한 공변량 모델
표 Colistin의 Basic Goodness-of-fit plots
표 Nasal carriage rate of burn patients with Staphylococcus aureus and methicillin-resistant S. aureus (MRSA)

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