초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
가. 폴리감마글루탐산의 구제역바이러스 억제 효능 검증 (I n vitro )
◉ 폴리감마글루탐산의 면역활성 효과 검증을 위한 In vitro 마우스 면역세포 자극실험 연구
○ 폴리감마글루탐산의 면역활성 효과 검증을 위해 면역세포인 mouse macrophage 세포에 폴리감마글루탐산을 자극시킨 후 (1) 인터페론 및 염증관련 유전자의 발현 유도여부 등을 확인하였으며, (2) 인터페론의 분비여부등을 확인하여 폴리감마글루탐산의 항바이러스 효능의 가능성 및 면역활성 여부를 검증하였음.
◉ 형광물질

Ⅳ. 연구개발결과
가. 폴리감마글루탐산의 구제역바이러스 억제 효능 검증 (I n vitro )
◉ 폴리감마글루탐산의 면역활성 효과 검증을 위한 In vitro 마우스 면역세포 자극실험 연구
○ 폴리감마글루탐산의 면역활성 효과 검증을 위해 면역세포인 mouse macrophage 세포에 폴리감마글루탐산을 자극시킨 후 (1) 인터페론 및 염증관련 유전자의 발현 유도여부 등을 확인하였으며, (2) 인터페론의 분비여부등을 확인하여 폴리감마글루탐산의 항바이러스 효능의 가능성 및 면역활성 여부를 검증하였음.
◉ 형광물질 (GFP)이 융합된 RNA 바이러스들을 이용한 폴리감마글루탐산의 감염 억제 연구(In vitro)
○ 형광물질 (GFP)이 융합된 RNA 바이러스들(Influenza-gfp, Vesicular Stomatitis virus-gfp, Coxsackivirus)을 이용한 폴리감마글루탐산의 감염 억제 효능 검증을 확인하기 위해 mouse macrophage 세포에 폴리감마글루탐산을 전처리한 후 바이러스 감염시 바이러스의 증식 억제 효능을 확인하였음.
◉ 폴리감마글루탐산으로 자극시킨 마우스 면역세포의 구제역바이러스 억제효능 검증
○ 폴리감마글루탐산의 구제역 바이러스 감염 억제 효능 검증을 확인하기 위해 mouse macrophage 세포에 폴리감마글루탐산을 전처리한 후 다양한 구제역바이러스 감염시 바이러스의 증식 억제 효능 시험을 수행하였으나 구제역바이러스가 mouse macrophage cell에서 증식하지 않음으로 인해 그 효능을 확인할 수 없었음.
◉ 폴리감마글루탐산으로 자극시킨 마우스 면역세포의 상등액을 이용한 상피세포에서의 형광물질(GFP)이 융합된 RNA 바이러스 억제효능 검증
○ 폴리감마글루탐산으로 자극시킨 mouse macrophage 세포의 상등액에 분비된 인터페론등의 면역활성 싸이토카인에 의해 자극된 상피세포의 RNA 바이러스 억제 효능을 확인하였음. 즉, 폴리감마글루탐산의 자극을 받은 mouse macrophage cell의 상등액내 인터페론과 같은 면역싸이토카인이 BHK-21 cell을 자극하여 항바이러스 status로 세포를 활성화 시킨 것이라 사료됨.
◉ 폴리감마글루탐산의 면역활성 효과 검증을 위한 In vitro 돼지 면역세포 자극 연구
○ 돼지 면역세포에 폴리감마글루탐산의 면역활성 효과 검증을 위해 돼지의 Alveolar macrophage cell과 Bone marrow macrophage cell을 분리 culture한 후 이들 세포에 폴리감마글루탐산을 자극시킨 후 인터페론의 분비여부, 염증성 cytokine들의 분비여부 등을 확인하여 폴리감마글루탐산의 항바이러스 효능의 가능성 및 면역활성 여부를 검증하였음.
◉ 폴리감마글루탐산으로 자극시킨 돼지 면역세포의 구제역바이러스 억제 효능 검증
○ 폴리감마글루탐산의 구제역 바이러스 감염 억제 효능 검증을 확인하기 위해 돼지의 면역세포인 Alveolar macrophage cell과 Bone marrow macrophage cell에 폴리감마글루탐산을 전처리한 후 구제역바이러스 감염시 바이러스의 증식 억제 효능 검증 시험을 수행하였으나 구제역바이러스가 돼지 면역세포에서 증식하지 않음으로 인해 그 효능을 확인할 수 없었음.
◉ 폴리감마글루탐산으로 자극시킨 돼지 면역세포의 상등액을 이용한 상피세포에서의 구제역바이러스 억제 효능 검증
○ 폴리감마글루탐산으로 자극시킨 돼지의 면역세포 Alveolar macrophage cell과 Bone marrow macrophage cell의 상등액에 분비된 인터페론등의 면역활성 싸이토카인에 의해 자극된 구제역 바이러스 민감 상피세포에서의 구제역바이러스 억제 효능을 확인하였음. 즉, 폴리감마글루탐산의 자극을 받은 돼지 면역세포들의 상등액내 인터페론과 같은 면역싸이토카인이 상피세포들을 자극하여 항바이러스 status로 세포를 활성화 시킨 것이라 사료됨.
나. 폴리감마글루탐산의 구제역바이러스 억제 효능 검증 (I n vivo )
◎ 고분자 폴리감마글루탐산의 In vivo 구제역바이러스 감염 억제 효능을 확인하기 위해 생후 1개월령의 SPF mini-pig (이유자돈)에 폴리감마글루탐산 (PGA)을 근육투여후 transmission 방법에 의한 challenge 시험을 두차례 수행하였으나 유의차를 확인할 수 없었음.
◎ 고분자 폴리감마글루탐산의 In vivo 구제역바이러스 감염 억제 효능을 확인하기 위해 생후 1개월령의 SPF mini-pig (이유자돈)에 폴리감마글루탐산 (PGA)을 근육투여후 direct infection방법에 의한 challenge 시험을 수행하였으나 유의차를 확인할 수 없었음.
다. 구제역바이러스 예방용 면역증강제제 제품화
◉ 폴리감마글루탐산 동물용의약품 주사제형을 확립하였음
◉ 폴리감마글루탐산 제품 생산공정 최적화 및 완제품 제조
○ 고순도 폴리감마글루탐산의 동물용의약품 주사액제 생산 공정 시스템을 구축하였으며, 완제품을 위한 시제품을 제조하였음.
◉ 일반 기준 규격, 시험법 및 자체 설정 (분자량 및 함량 측정법 등) 규격 확립
○ 고분자량 폴리감마글루탐산의 평균분자량 측정법을 겔여과법과 광산란법을 이용하여 바이러스 감염억제 활성 보유 평균분자량 측정 및 기준규격을 확립하였음.
○ 고분자량 폴리감마글루탐산의 유효성분 함량 기준 확립을 위하여 아미노산 측정법 및 겔 여과법을 상호 보완하여 유효성분 함량 기준규격을 확립함
◉ 바이러스 감염억제 활성검증 시험법 확립 및 시설 보안
○ 고분자량 폴리감마글루탐산의 제품 규격 및 품질관리를 위하여 바이러스 감염억제 활성 측정법을 확립하였음.
○ 대식세포를 이용한 TNF-α, IFN-β cytokine 분비 활성 분석법을 확립하였음
○ 동물용 의약품 폴리감마글루탐산 액상 제형의 품질 확보를 위하여 크린부스를 설치하였음.
○ 동물용 의약품 폴리감마글루탐산 액상 제형의 보관을 위한 cooling container을 설치하였음.
◉ 폴리감마글루탐산의 안전성 시험
◎ 국소독성시험으로 토끼를 이용하여 피부자극시험, 2주간 연속피부자극성시험, 안자극시험을
시험을 수행하였음.
◎ 면역독성시험으로 기니픽을 이용하여 광감작시험과 피부감작성시험을 수행하였음.
◎ 광독성시험으로 기니픽을 이용하여 수행하였음.
◎ 폴리감마글루탐산의 닭에 대한 근육투여 용량에 대한 안전성 시험을 수행하였음.
◉ 폴리감마글루탐산의 독성 시험
◎ 마우스와 비글견을 이용한 근육주사 독성시험을 수행하였음.
◎ 랫트와 토끼를 이용한 생식독성(최기형성) 시험을 수행하였음.
◉ 폴리감마글루탐산의 약리, 잔류, 대사 시험
◎ ICP-MS를 이용한 체내에서 Gd이 부착된 폴리감마Ⓡ의 정량화를 통한 잔류 및 대사시험 수행하였음.
라. 폴리감마글루탐산의 현장적용 기술
◉ 구제역 백신과 폴리감마글루탐산의 병용투여에 의한 백신효능 증강 시험
◎ 구제역 바이러스 백신과의 폴리감마글루탐산의 전투여, 병용투여, 후투여등에 의한 폴리감마 글루탐산의 면역증강 및 백신효능 증가 효과를 검증하였음.

Abstract ▼

In the first line of defense against viruses, innate immune responses including type 1 interferons and cytokines (IL-1β) initiate host antiviral responses. The discovery in 2000 that two proteins from vaccinia virus interfere with Toll-like receptor (TLR) signalling was the first indication that TLR

In the first line of defense against viruses, innate immune responses including type 1 interferons and cytokines (IL-1β) initiate host antiviral responses. The discovery in 2000 that two proteins from vaccinia virus interfere with Toll-like receptor (TLR) signalling was the first indication that TLRs might be important in the sensing of viruses. Ligands for TLRs are conserved structural motifs on microbes termed pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). These PAMPs include lipopolysaccharide (LPS), flagellin, lipoproteins, glycolipids and nucleic acids of bacteria, virus, parasitic or fungal origins. After recognition of these PAMPs by TLRs, turn on the signal pathway for type 1 interferons and pro-inflammatory cytokines and ultimately, induce IFNs and cytokines. In addition, signalling promotes the maturation of antigen-presenting cells (APCs). Importantly, TLR ligands may influence the differentiation of naive T-helper cell towards either a TH1 or TH2 phenotype, conferring protective immunity in the host. According to these ability, TLR ligands have led to their exploitation as both prophylactic agents for enhancing host immune response against pathogens and vaccine adjuvants to help robust immune response against vaccines.
Aside from development of antiviral drugs and vaccines, natural substances especially, TLR ligands are being investigated recently for their ability to inhibit or prevent virus infection. One such natural substance to discuss on this study is poly–γ–glutamic acid (γ–PGA). γ–PGA was first discovered from Chungkookjang, a traditional Korean fermented soybean food. Recent studies revealed that γ–PGA has a safe and satisfactory adjuvant function, innate immune inducible role, antitumor effect, among others. According to our early findings, the high molecular weight (5,000 kDa) γ–PGA induces type I IFNs through the TLR4 signal pathway in murine macrophage cells, thus this compound has been hypothesized to be involved with the antiviral state in cells.
In this projects, we evaluates the following items,
◎ We confirmed anti-FMDV activities of γ–PGA using in murine macrophage and porcine bone-marrow macrophage cells.
◎ We confirmed that γ–PGA can induce the antiviral status (Induction of genes and proteins for Type I interferons and cytokines) of murine macrophage and porcine bone-marrow macrophage cells and inhibits virus replication.
◎ We tested anti-FMDV activities of γ–PGA using FMDV challenge model which containing high virulence Andong strain and SPF-mini Pigs.
◎ We established the production process and test standard for production of γ–PGA
◎ We evaluated the adjuvant function of γ–PGA using the commercialized FMDV vaccine in swine farms.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 15
• CONTENTS ... 16
• 목차 ... 17
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 18
• 제 1 절 연구개발의 목적 ... 18
• 제 2 절 연구의 필요성 및 범위 ... 18
• 제 3 절 연구개발 추진전략 및 추진체계 ... 22
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 24
• 제 1 절 국내·외 관련분야에 대한 기술개발현황 ... 24
• 제 2 절 연구결과가 국내·외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 25
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 27
• 제 1 절 폴리감마글루탐산의 구제역바이러스 억제 효능 검증 ... 27
• 제 2 절 구제역바이러스 예방용 면역증강제제 제품화 ... 44
• 제 3 절 폴리감마글루탐산의 현장적용 기술 ... 54
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 57
• 제 1 절 연구개발목표의 달성도 ... 57
• 제 2 절 관련분야의 기술발전에의 기여도 ... 59
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 61
• 제 1 절 실용화·산업화 계획 ... 61
• 제 2 절 교육·지도·홍보 등 기술확산 계획 등 ... 62
• 제 3 절 특허, 품종, 논문 등 지식재산권 확보계획 ... 62
• 제 4 절 추가연구, 타연구에 활용 계획 ... 63
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 64
• 제 7 장 연구시설‧장비 현황 ... 64
• 제 8 장 참고문헌 ... 64
• 끝페이지 ... 69