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Kafe 바로가기주관연구기관 | 안동대학교 AnDong National University |
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연구책임자 | 김용균 |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2013-11 |
과제시작연도 | 2012 |
주관부처 | 교육과학기술부 |
사업 관리 기관 | 한국연구재단 |
등록번호 | TRKO201400008141 |
과제고유번호 | 1345170063 |
DB 구축일자 | 2014-06-07 |
아이코사노이드는 곤충의 다양한 세포성 면역 반응을 중개한다. 본 연구는 면역반응에 따라 혈구세포 밀도 변화에 대한 아이코사노이드의 새로운 중개 기능을 밝히기 위해 수행되었다. 파밤나방(Spodoptera exigua) 5령충은 세균 감염에 따라 2 시간이 지나면 총혈구수의 현격한 증가를 보였다. 이 총혈구수 증가는 주로 부정형혈구와 소구형혈구 밀도의 증가에 기인되어 있다. 파밤나방 유충에 phospholipase A2PLA2) 억제자인 dexamethasone을 처리하면 세균 처리에 의한 총혈
아이코사노이드는 곤충의 다양한 세포성 면역 반응을 중개한다. 본 연구는 면역반응에 따라 혈구세포 밀도 변화에 대한 아이코사노이드의 새로운 중개 기능을 밝히기 위해 수행되었다. 파밤나방(Spodoptera exigua) 5령충은 세균 감염에 따라 2 시간이 지나면 총혈구수의 현격한 증가를 보였다. 이 총혈구수 증가는 주로 부정형혈구와 소구형혈구 밀도의 증가에 기인되어 있다. 파밤나방 유충에 phospholipase A2PLA2) 억제자인 dexamethasone을 처리하면 세균 처리에 의한 총혈구수 변화가 일어나지 않았다. 하지만 dexamethasone을 처리한 유충에 PLA2의 촉매산물인 arachidonic acid를 첨가하면 총혈구수 증가가 회복되었다. 이러한 혈구 밀도 변화에 기인하는 아이코사노이드를 추적하기 위해 cyclooxygenase (COX)의 억제자인 naproxene을 처리하며 총혈구수 증가가 억제되고, lipoxygenase (LOX)의 억제자인 esculetin을 처리하면 총혈구수 증가가 유지되어 COX 산물이 세균 침입에 따른 총혈구수 증가에 관여하는 것으로 나타났다. COX의 생산물인 prostaglandin E2 (PGE2)를 세균 없이 단독으로 처리할 때도 총혈구수의 뚜렷한 증가를 나타냈다. 이러한 결과는 파밤나방의 세포성 면역반응 과정에서 총혈구수 증가를 중개하는 아이코사노이드의 새로운 기능을 제시하고 있다.파밤나방의 혈구세포에 대한 EST가 분석되었다. 발현체로부터 면역관련 유전자들을 추출했고, 이를 통해 Toll/Imd 신호전달과정이 파밤나방에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 다시 각 신호체계의 존재성을 규명하기 위해 Toll 및 Imd 신호에 특이적 dsRNA를 제작하여 이들 신호의 존재를 규명한 결과 특이적 항생단백질이 발현된다는 것을 밝혔다. 곤충병원세균인Xenorhabdus nematophila는 이들 유전자 발현을 억제시켰으며, 이는 이 세균에서 유리된 PLA2 억제자인 benzylideneacetone의 처리에 의해서도 가능하여졌다. 본 연구는 아이코사노이드 신호체계가 Toll/Imd 신호전달과정과 관련이 있다는 것을 제시하고 있다. 곤충병원성곰팡이(Beauveria bassiana:Bb)의 침입에 따라 일어나는 신호전달과정이 본 연구에서 밝혀졌다. Bb에 대해서 파밤나방은 Toll 신호 전달과정을 발현시켰으며, 이에 따라 PLA2 활성이 조절되었다. 본 연구에서는 먼저 파밤나방에 존재하는 PLA2의 종류를 조직별로 보여주었다. Bb 침입은 이들 모든 조직의 PLA2 활성을 높였다. Bb 침입에 따라 Toll 신호 체계에 특이적 항생단백질이 발현되었으며, 이들의 발현은 Toll에 특이적 dsRNA를 처리하여 억제시켰으나, Relish에 특이적 dsRNA는 전혀 영향을 주지 않았다. 본 연구는 다시 Toll RNA interference (RNAi)가 Bb에 대한 PLA2의 활성을 제고를 억제시켰으며, 이는 혈구세포 소낭형성의 억제를 일으키게 했다. 이상의 결과는 Bb의 감염에 따라 Toll 면역 신호가 일어났으며, 이는 PLA2 활성을 유도하고 면역 반응을 일으켰다고 밝혀졌다. 편도혈구의 붕괴에 관여되는 프로스타글란딘(PG)류의 수용체를 동정하는 데 연구 목적을 가졌다. PG 수용체를 찾기 위해 혈구세포의 EST를 분석하였으며 3가지 PGRP 유전자 가운데 rhodopsin type의 유전자를 동정했다. 이 PGRP는 전형적 7개 생체막투과 영역을 지녔으며 대부분의 N-glycosylation 부위가 세포외 영역에서 추정되었다. 이 유전자의 발현이 모든 발육ㅌ에서 나타났으며 특별히 햘구와 소화관에서 발현이 특이적으로 나타났다. 세균 감염에 따라 이 유전자 발현량이 증가했다. 흥미로운 점은 FISH 분석 결과는 이 유전자의 발현이 혈구세포들 가운데 편도혈구에서만 나타났다. 이 유전자의 발현을 RNAi로 억제한 결과 PGE2의 노출에도 편도혈구의 붕괴가 일어나지 않고 이에 따라 페놀옥시데이즈 활성 또한 증가하지 않았다. 이 수용체에 대한 PGE2의 직접적 결합 능력을 알아보기 위해 in vitro 수용체와 리간드 결합 실험을 통해 RNAi 처리된 혈구세포의 경우 PGE2의 결합능력이 크게 감소하는 것을 관찰하였다. 이상의 결과는 본 연구에서 클로닝한 단백질이 PGE2에 대한 수용체라는 것을 밝히게 되었다. 편도혈구는 페놀옥시데이즈의 전구체를 생산하고 저장하고 있다. 분비를 위한 N 말단에 신호펩타이드가 프로페놀옥시데이즈에는 존재하지 않아 유일한 혈장으로 배출은 편도혈구의 세포붕괴에 의존하게 된다. 본 연구는 편도혈구의 붕괴에 관여하는 소듐채널 단백질을 클로닝하고 이 단백질의 기능을 밝혔다. 먼저 편도혈구의 붕괴는 소듐이온에 높은 의존성을 보였다. 혈구세포로부터 유리된 EST에서 소듐채널 유전자를 찾았고, 이는 NKCC (sodium-potassium chloride cotransporter)와 아미노산 서열 유사성을 보였다. NKCC는 모두 조직 및 시기에서 발현되었으나, 면역 반응에 따라 더욱 그발현량이 높아진다는 것을 qRT-PCR로 분석했다. NKCC에 특이적 억제자인 bemetanide와 chlorothiazide는 편도혈구의 붕괴를 억제시켰다. RNAi를 통해 NKCC의 발현을 억제시키면 PGE2의 처리에도 편도혈구의 붕괴가 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 클로닝한 NKCC 유전자 산물이 편도혈구의 세포붕괴를 초래한다는 것으로 판명되었다. 편도혈구는 페놀옥시데이즈의 전구체를 생산하고 저장하고 있다. 분비를 위한 N 말단에 신호펩타이드가 프로페놀옥시데이즈에는 존재하지 않아 유일한 혈장으로 배출은 편도혈구의 세포붕괴에 의존하게 된다. 본 연구는 편도혈구의 붕괴에 관여하는 소듐채널 단백질을 클로닝하고 이 단백질의 기능을 밝혔다. 먼저 편도혈구의 붕괴는 소듐이온에 높은 의존성을 보였다. 혈구세포로부터 유리된 EST에서 소듐채널 유전자를 찾았고, 이는 NKCC(sodium-potassium chloride cotransporter)와 아미노산 서열 유사성을 보였다. NKCC는 모두 조직 및 시기에서 발현되었으나, 면역 반응에 따라 더욱 그 발현량이 높아진다는 것을 qRT-PCR로 분석했다. KCC에 특이적 억제자인 bemetanide와 chlorothiazide는 편도혈구의 붕괴를 억제시켰다. RNAi를 통해 NKCC의 발현을 억제시키면 PGE2의 처리에도 편도혈구의 붕괴가 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 클로닝한 NKCC 유전자 산물이 편도혈구의 세포붕괴를 초래한다는 것으로 판명되었다.
과제명(ProjectTitle) : | - |
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연구책임자(Manager) : | - |
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