RNA interference(RNAi)는 살아있는 세포 내에서 유전자의 표현 형을 억제하는 작용을 하고 Chitinase는 곤충이 탈피를 하는 동안 오래된 큐티클의 분해와 재흡수를 도와주는 효소로 알려져 있다. 이러한 작용기작을 이용하는 연구를 수행하기 위하여 담배거세미나방의 chitinase와 관련하여 탈피저해 효과를 조사하였다. 담배거세미나방 5령 유충으로부터 RNA를 추출하고 이용하여 cDNA를 합성하고 약 700 bp의 chitinase를 증폭 하였다. 증폭한 PCR product를 pGEM T-easy vector에 cloning하여 competent cell (E.coli)에 형질전환 시키고 mixture를 배양 후 colony를 선발하고 plasmid DNA를 추출하였다. 그 결과 약 3 kb size의 vector band와 약 700 bp의 insert band를 확인 할 수 있었다. dsRNA를 합성하기 위해 각각의 DNA를 Spe I과 Nco I의 제한 효소 처리를 하여 linear form의 DNA로 만들었다. dsRNA 합성 후 약 $10{\mu}g/{\mu}l$의 농도로 $5{\mu}l$씩 담배거세미나방 4령 유충에 주입하였다. 그 결과 유충-유충간의 탈피에서는 기형발육, 탈피저해, 표피의 색소 변이가 나타났다. 번데기-성충 간의 탈피에서는 탈피저해, 날개변이, 기형발육 현상을 볼 수 있었다. 용화율의 경우 무처리구 83.3%, DW 처리구 78.3%, dsRNA 처리구 66.7%로 나타났다. 우화율의 경우 무처리구 90.0%, DW 처리구 72.3%, dsRNA 처리구 65.0%로 나타나 dsRNA를 처리한 그룹에서 상대적인 탈피 저해 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 변이율의 경우 무처리구 8.9%, DW 처리구 2.9%, dsRNA 처리구 19.2%로 dsRNA를 주입한 처리구에서 변이율이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 표현형적 변이는 dsRNA 주입 후 약 18 시간 이후부터 뚜렷하게 나타나는 것을 볼 수 있었다.
RNA interference(RNAi)는 살아있는 세포 내에서 유전자의 표현 형을 억제하는 작용을 하고 Chitinase는 곤충이 탈피를 하는 동안 오래된 큐티클의 분해와 재흡수를 도와주는 효소로 알려져 있다. 이러한 작용기작을 이용하는 연구를 수행하기 위하여 담배거세미나방의 chitinase와 관련하여 탈피저해 효과를 조사하였다. 담배거세미나방 5령 유충으로부터 RNA를 추출하고 이용하여 cDNA를 합성하고 약 700 bp의 chitinase를 증폭 하였다. 증폭한 PCR product를 pGEM T-easy vector에 cloning하여 competent cell (E.coli)에 형질전환 시키고 mixture를 배양 후 colony를 선발하고 plasmid DNA를 추출하였다. 그 결과 약 3 kb size의 vector band와 약 700 bp의 insert band를 확인 할 수 있었다. dsRNA를 합성하기 위해 각각의 DNA를 Spe I과 Nco I의 제한 효소 처리를 하여 linear form의 DNA로 만들었다. dsRNA 합성 후 약 $10{\mu}g/{\mu}l$의 농도로 $5{\mu}l$씩 담배거세미나방 4령 유충에 주입하였다. 그 결과 유충-유충간의 탈피에서는 기형발육, 탈피저해, 표피의 색소 변이가 나타났다. 번데기-성충 간의 탈피에서는 탈피저해, 날개변이, 기형발육 현상을 볼 수 있었다. 용화율의 경우 무처리구 83.3%, DW 처리구 78.3%, dsRNA 처리구 66.7%로 나타났다. 우화율의 경우 무처리구 90.0%, DW 처리구 72.3%, dsRNA 처리구 65.0%로 나타나 dsRNA를 처리한 그룹에서 상대적인 탈피 저해 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 변이율의 경우 무처리구 8.9%, DW 처리구 2.9%, dsRNA 처리구 19.2%로 dsRNA를 주입한 처리구에서 변이율이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 표현형적 변이는 dsRNA 주입 후 약 18 시간 이후부터 뚜렷하게 나타나는 것을 볼 수 있었다.
RNA interference (RNAi) is the method which controls phenotypes of gene in live cells. Chitinase is the enzyme helping digestion and absorption of old cuticles during the ecdysis of insects. In order to investigate molting-inhibition effect with the chitinase related gene in Spodoptera litura, RNA w...
RNA interference (RNAi) is the method which controls phenotypes of gene in live cells. Chitinase is the enzyme helping digestion and absorption of old cuticles during the ecdysis of insects. In order to investigate molting-inhibition effect with the chitinase related gene in Spodoptera litura, RNA was extracted from the $5^{th}$ instars. cDNA was synthesized and then we obtained about 700 bp size chitinase. After PCR products were cloned into a pGEM T-easy vector, colonies were picked. DNA was extracted from the colony cultures. EcoR I enzyme was used to check whether PCR products were inserted or not. And then we confirmed vector band of about 3 kb and insert band of about 700 bp. To synthesize the dsRNA, each DNA was cut with Spe I and Nco I enzymes (Circular DNA became lineared DNA). After synthesis of dsRNA, approximately 5 ul dsRNA was injected into the $3^{rd}$ abdominal segment of S. litura $4^{th}$ larvae. The concentration of dsRNA was about $10{\mu}g/{\mu}l$. We confirmed larval-larval molting : there were phenotypically abnormal individuals - for instance malformation, molting inhibition and change of integument color. Pupaadult molting : there were phenotypically abnormal individuals - for instance molting inhibition, change of wings and malformation. Also we could investigate the pupation, emergence and variation about noninjection, treated with DW and dsRNA. Each pupation was non-injection 83.3%, DW 78.3% and dsRNA 66.7%. Each emergence was non-injection 90.0%, DW 72.3% and dsRNA 65.0%. So we considered that chitinase dsRNA induced molting inhibition effect. But each variation was non-injection 8.9%, DW 2.9% and dsRNA 19.2%. Therefore dsRNA group showed the highest variation value. When 18 hours after injecting dsRNA, we could obtain abnormal individual.
RNA interference (RNAi) is the method which controls phenotypes of gene in live cells. Chitinase is the enzyme helping digestion and absorption of old cuticles during the ecdysis of insects. In order to investigate molting-inhibition effect with the chitinase related gene in Spodoptera litura, RNA was extracted from the $5^{th}$ instars. cDNA was synthesized and then we obtained about 700 bp size chitinase. After PCR products were cloned into a pGEM T-easy vector, colonies were picked. DNA was extracted from the colony cultures. EcoR I enzyme was used to check whether PCR products were inserted or not. And then we confirmed vector band of about 3 kb and insert band of about 700 bp. To synthesize the dsRNA, each DNA was cut with Spe I and Nco I enzymes (Circular DNA became lineared DNA). After synthesis of dsRNA, approximately 5 ul dsRNA was injected into the $3^{rd}$ abdominal segment of S. litura $4^{th}$ larvae. The concentration of dsRNA was about $10{\mu}g/{\mu}l$. We confirmed larval-larval molting : there were phenotypically abnormal individuals - for instance malformation, molting inhibition and change of integument color. Pupaadult molting : there were phenotypically abnormal individuals - for instance molting inhibition, change of wings and malformation. Also we could investigate the pupation, emergence and variation about noninjection, treated with DW and dsRNA. Each pupation was non-injection 83.3%, DW 78.3% and dsRNA 66.7%. Each emergence was non-injection 90.0%, DW 72.3% and dsRNA 65.0%. So we considered that chitinase dsRNA induced molting inhibition effect. But each variation was non-injection 8.9%, DW 2.9% and dsRNA 19.2%. Therefore dsRNA group showed the highest variation value. When 18 hours after injecting dsRNA, we could obtain abnormal individual.
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문제 정의
최근에는 새로운 해충 방제방법의 하나로 파밤나방(Spodoptera exigua) 유충에 chitinase gene의 dsRNA를 주입하여 발육이나 변태를 저해하는 방법이 시도되고 있다(Zhang et al, 2012). 따라서 본 연구에서는 담배거세미나방의 탈피에 관여하는 chitinase의 RNA를 이용하여 탈피 저해 효과를 확인을 시험하였다.
본 연구는 곤충 생육에 필수적 요건으로 탈피 과정에 관여하는 chitinase gene을 dsRNA로 합성하여 그것을 담배거세미나방 유충에 주입함으로써 정상적인 유전자 발현의 저해여부에 따라서 형태적 변이가 일어나는 것을 관찰을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 chitinase gene의 발현을 저해하게 하여 담배거세미나방의 탈피억제하게 하는 방법으로 생물적 저해방법을 찾고자 검토되었다.
본 연구는 곤충 생육에 필수적 요건으로 탈피 과정에 관여하는 chitinase gene을 dsRNA로 합성하여 그것을 담배거세미나방 유충에 주입함으로써 정상적인 유전자 발현의 저해여부에 따라서 형태적 변이가 일어나는 것을 관찰을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 chitinase gene의 발현을 저해하게 하여 담배거세미나방의 탈피억제하게 하는 방법으로 생물적 저해방법을 찾고자 검토되었다.
제안 방법
5 μl Micro syringe 7000 series Modified Microliter Syringe (Hamilton, Germany)를 이용하여 dsRNA를 주입하였다.
Phenotypic changes of larva according to the time elapsed after treatments. After injection, individuals were observed each 6 hours (6 h, 12 h, 18 h and 24 h). There was no change at any time in non-injection and injected with DW.
Ampicillin LB plate에서 위성 colony가 없는 하얀색의 단일 colony를 선발하여 3 ml의 Ampicillin LB 액체 배지에서 37℃, 250 rpm, 사면 조건으로 12시간 동안 진탕 배양하였다. Ampicillin LB 배 지에 배양한 배양액에서 Maestrogen High-Speed Plasmid Mini Kit (Maestrogen, Korea)를 이용하여 각각의 Plasmid DNA를 추출하였다. 방법은 kit의 매뉴얼을 일부 수정 하였다.
Chitinase gene을 cloning하기 위해 2가지 PCR product를 각각 pGEM® T-easy vector (Promega, USA)에 삽입시켰다.
Chitinase gene의 dsRNA를 담배거세미나방 4령 유충에 주입한 후 시간에 따른 유충의 표현형적 변이를 관찰하였다. 주입 후 6, 12, 18, 24시간마다 각각의 개체 변이를 확인한 결과, 주입 후 6시간째에 주입한 개체의 등쪽 표피에서 색소침적이 덜 된 변이를 확인할 수 있었다(Fig.
EZ-CloningTM kit(Enzynomics, Korea)의 매뉴얼을 일부 변경하여 실험을 진행하였다. Ice에 competent cell이 들어 있는 tube를 고정시켜 cell이 slush 상태로 조금 녹을 때 까지 기다렸다가 Ligation mixture 3 μl를 competent cell 중간 부분에 흔들림 없이 넣어주었다.
PCR product를 pGEM® T-easy vector에 ligation 시켜서 competent cell에 형질전환하고 IPTG와 X-Gal이 첨가된 Ampicillin LB plate에 도말하여 분리한 DNA에 chitinase gene이 존재하는지의 여부를 확인 하였다.
사용한 primer 정보는 Table 1에 제시하였다. PCR의 조건은 95℃, 15분, 35cycles로 95℃, 30초, 55℃, 1분, 72℃, 1분 그리고 72℃, 5분으로 하였다.
Promega T7 RiboMax Express RNAi System kit (Promega, USA)를 이용하여 dsRNA를 합성하였다. 방법은 매뉴얼을 일부 수정하여 진행하였다.
RNA interference 생물검정은 담배거세미나방 4령 유충을 대상으로 실시하였다. 5 μl Micro syringe 7000 series Modified Microliter Syringe (Hamilton, Germany)를 이용하여 dsRNA를 주입하였다.
그러나 Forward + T7-Reverse primer set로 증폭한 것은 Nco I enzyme (TaKaRa, Japan)으로 잘랐다. Spe I과 Nco I enzyme 처리는 매뉴얼을 일부 수정하였다.
Spreading 방법은 pGEM® T-easy vector 매뉴얼을 일부 변경하여 실험에 적용하였다.
Target gene이 chitinase는 아니지만 탈피에 관여하는 β-N-acetylglucosaminidase를 이용해 표현형적 변이 및 mRNA 발현량을 비교하였다.
T-easy vector (Promega, USA)에 삽입시켰다. Usage Information을 일부 변경하여 reaction mixture를 만들었다. Reaction mixture의 조성은 PCR product 2 μl, pGEM® T-easy vector 1 μl, Ligase-TaKara SolI 3 μl로 하였다.
ToYoBo Revertra Ace-α-kit (ToYoBo, Japan)를 이용하였고, primer는 Oligo dT (20)를 사용하였다. cDNA 합성은 kit의 매뉴얼대로 진행하였다.
dsRNA를 합성하기 위해 각각의 plasmid DNA를 linear한 형태로 처리하였다. T7-Forward + Reverse primer set로 증폭한 것은 Spe I enzyme (TaKaRa, Japan)으로 잘랐다.
pGEM® Teasy vector에서 Spe I과 Nco I의 site가 각각 하나씩만 존재하기 때문에 전기영동 결과 약 3,700 bp 근처에서 하나의 band를 확인한 lineared DNA를 주형으로 하여 dsRNA를 합성하였다.
그러므로 본 연구는 담배거세미나방 4령 유충에 dsRNA를 주입하여 5령으로의 탈피, 용화 그리고 우화에 대한 표현형적 변이를 관찰하였다.
주입되는 dsRNA의 양은 5 μl이었으며, dsRNA의 농도는 약 10 μg/μl이었다. 담배거세미나방 유충 복부 2~3절에 알코올 소독을 한 뒤 syringe를 이용해 dsRNA를 주입하였다. 대조구는 2가지 그룹으로 어떤 것도 주입하지 않는 무처리구 그룹과 DW를 5 μl씩 주입한 그룹 으로 나누었다.
담배거세미나방의 총 RNA를 분리한 다음 NanoDrop을 이용해 농도를 측정하고 1 μg의 template으로 cDNA를 합성하고 primer set를 이용하여 chitinase gene을 증폭하였다.
대조구는 2가지 그룹으로 어떤 것도 주입하지 않는 무처리구 그룹과 DW를 5 μl씩 주입한 그룹 으로 나누었다.
따라서 pGEM® T-easy vector에 insertion이 제대로 되었는지 확인하기 위해 EcoR I enzyme (TaKaRa, Japan) 처리를 하였다.
(2012)의 결과보다 RNA interference 저해 효과가 조금 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 실험에서는 우화를 하더라도 완전히 치사하지 않은 개체도 조사하여 변이율로 나타내었다. 하지만, 파밤나방 4령 유충을 대상으로 키틴합성과 관련된 유전자의 저해효과를 확인한 Chen et al.
52%를 나타내었다. 또한 풀무치(Locusta migratoria)를 대상곤충으로 하여 RNAi 실험을 하였다. Target gene이 chitinase는 아니지만 탈피에 관여하는 β-N-acetylglucosaminidase를 이용해 표현형적 변이 및 mRNA 발현량을 비교하였다.
발표된 논문에서는 2종류의 chitinase (Sechi 그리고 Sechi-h)에 대해 실험을 하였는데, 각각 5 μg/5μl의 농도로 파밤나방 5령 유충에 dsRNA를 주입하였다.
Ampicillin LB 배 지에 배양한 배양액에서 Maestrogen High-Speed Plasmid Mini Kit (Maestrogen, Korea)를 이용하여 각각의 Plasmid DNA를 추출하였다. 방법은 kit의 매뉴얼을 일부 수정 하였다.
Promega T7 RiboMax Express RNAi System kit (Promega, USA)를 이용하여 dsRNA를 합성하였다. 방법은 매뉴얼을 일부 수정하여 진행하였다. RiboMax Express T7 2 × buffer 10 μl, Lineared DNA 약 1 μg, Enzyme mix, T7 express 2 μl로 총 volume을 20 μl로 맞춘다.
약 1 µg의 RNA를 이용해 cDNA를 합성하였다.
조건은 HOT FIREPol® DNA Polymerase 0.5 μl (HOT START DNA Polymerase), 10 × Buffer B25Mg 5 μl, 20 mM dNTP mix 0.5 μl, Forward primer 1 μl(10pM), Reverse Primer 1 μl (10 pM), DNA template 5 μl (Solis BioDyne, Estonia)로 하여 총 volume을 50 μl씩 하였다.
따라서 pGEM® T-easy vector에 insertion이 제대로 되었는지 확인하기 위해 EcoR I enzyme (TaKaRa, Japan) 처리를 하였다. 처리 조건은 매뉴얼을 일부 수정하였다. Substrate DNA 5 μl (약 500 ng), EcoR I 0.
총 RNA는 담배거세미나방 5령 유충으로부터 추출하였다. 추출은 Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, Korea)를 이용하였고 kit의 매뉴얼대로 진행하였다. 약 1 µg의 RNA를 이용해 cDNA를 합성하였다.
실험한 개체의 인공사료는 생물검정이 모두 완료되는 기간인 처리된 개체가 용화될 때 까지 매일 매일 제공해 주었다. 표현형적 변이를 관찰하기 위해 각 처리구 당 담배거세미나방을 20마리씩 선발하여 실험하였고 3반복으로 실시하였다. 그리고 시간에 따른 dsRNA의 표현형적 발현 양상을 관찰하기 위해 각 처리구 당 10마리씩 선발하였다.
Target gene이 chitinase는 아니지만 탈피에 관여하는 β-N-acetylglucosaminidase를 이용해 표현형적 변이 및 mRNA 발현량을 비교하였다. 풀무치 2령 약충에 dsRNA를 주입하여 약충-약충 간의 탈피, 5령 약충에 주입하여 약충-성충 간의 탈피 저해 현상을 관찰하였다. 각 처리구 당 50% 이상의 치사율을 보였다(Rong et al.
한편 Chitinase dsRNA가 발육상에 미치는 영향을 알아보기 위해 각 개체가 성충으로 우화할 때까지 관찰하였다 (Fig. 5). 그 결과 성충으로 우화시 표현형적 변이 양상은 탈피저해, 날개변이, 기형발육과 같은 3가지 유형으로 나타났다.
대상 데이터
도말 plate는 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. Ampicillin LB plate에서 위성 colony가 없는 하얀색의 단일 colony를 선발하여 3 ml의 Ampicillin LB 액체 배지에서 37℃, 250 rpm, 사면 조건으로 12시간 동안 진탕 배양하였다. Ampicillin LB 배 지에 배양한 배양액에서 Maestrogen High-Speed Plasmid Mini Kit (Maestrogen, Korea)를 이용하여 각각의 Plasmid DNA를 추출하였다.
dsRNA를 합성은 circular form의 DNA를 제한효소로 잘라 lineared DNA로 만들었으며 T7-FW+RV primer set를 이용한 sample은 Spe I enzyme을 사용하였다. pGEM® Teasy vector에서 Spe I과 Nco I의 site가 각각 하나씩만 존재하기 때문에 전기영동 결과 약 3,700 bp 근처에서 하나의 band를 확인한 lineared DNA를 주형으로 하여 dsRNA를 합성하였다.
그 중에서도 농업해충으로 방제하기 어려운 담배거세미나방(S. litura, tobacco cutworm or common cutworm)을 본 연구의 방제대상 해충으로 선발하였다. 이 종은 나비목 (Lepidoptera) 밤나방과(Noctuidae) Spodoptera 속에 속하는 난방제 해충으로 아시아, 호주 등에 분포한다.
표현형적 변이를 관찰하기 위해 각 처리구 당 담배거세미나방을 20마리씩 선발하여 실험하였고 3반복으로 실시하였다. 그리고 시간에 따른 dsRNA의 표현형적 발현 양상을 관찰하기 위해 각 처리구 당 10마리씩 선발하였다.
본 실험에 사용된 담배거세미나방(Spodoptera litura)은 2004년 농촌진흥청 국립농업과학원으로부터 분양받아 온도 25 ± 2℃, 광조건 16L : 8D, 상대습도 50~60% 조건(Kim et el., 2008)으로 누대 사육하였다.
본 연구에서는 담배거세미나방 4령 유충에 dsRNA를 주입하였다. 그러나 보고된 다른 논문에서는 파밤나방 5령 유충에 chitinase gene의 dsRNA를 주입하였다.
총 RNA는 담배거세미나방 5령 유충으로부터 추출하였다. 추출은 Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, Korea)를 이용하였고 kit의 매뉴얼대로 진행하였다.
이론/모형
5 μl, Forward primer 1 μl(10pM), Reverse Primer 1 μl (10 pM), DNA template 5 μl (Solis BioDyne, Estonia)로 하여 총 volume을 50 μl씩 하였다. PCR에 사용한 primer는 GenBank accession number AB032107 (Shinoda et al., 2001)을 방법으로 제작하였다. dsRNA 합성을 위해 각각의 primer에 T7 polymerase promoter sequence를 붙였다.
성능/효과
pGEM® Teasy vector에서 Spe I과 Nco I의 site가 각각 하나씩만 존재하기 때문에 전기영동 결과 약 3,700 bp 근처에서 하나의 band를 확인한 lineared DNA를 주형으로 하여 dsRNA를 합성하였다. dsRNA를 1% Agarose gel에 100V, 35분 동안 전기 영동한 결과 약 700 bp 근처에서 band가 나타났다 (Fig. 3).
발표된 논문에서는 2종류의 chitinase (Sechi 그리고 Sechi-h)에 대해 실험을 하였는데, 각각 5 μg/5μl의 농도로 파밤나방 5령 유충에 dsRNA를 주입하였다. 그 결과 Sechi dsRNA를 주입한 그룹에서는 용화율 52.02%, 우화율 40.38%를 나타내었다. Sechi-h dsRNA를 주입한 그룹에서는 용화율 72.
5). 그 결과 성충으로 우화시 표현형적 변이 양상은 탈피저해, 날개변이, 기형발육과 같은 3가지 유형으로 나타났다. 첫 번째로 탈피를 저해 받은 개체는 우화 시 번데기 껍질을 제대로 벗지 못해 온전한 성충이 되지 못하고 사망하였다.
그 결과 약 3,000 bp 근처에서 pGEM® T-easy vector의 band가 확인되었고 약 700 bp 근처에서 PCR product인 chitinase의 band가 확인되었다(Fig. 2).
, 2013). 그러나 본 연구에서는 chitinase gene의 dsRNA를 주입한 그룹에서 용화율 66.7%, 우화율 65.0% 그리고 변이율 19.2% (Table 1)를 나타내어 Zhang et al. (2012)의 결과보다 RNA interference 저해 효과가 조금 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 실험에서는 우화를 하더라도 완전히 치사하지 않은 개체도 조사하여 변이율로 나타내었다.
담배거세미나방 4령 유충에 농도가 약 10 μg/μl인 dsRNA 5 μl를 주사한 결과, 정상개체에 비해 3가지 양상의 표현형적 변이가 나타났다.
그러나 두 번째 변이 유형인 날개 변이 개체는 양쪽 날개가 몸통을 완전히 덮지 못할 뿐 성충으로 우화하는 데에는 큰 영향을 끼치지 않았다. 반면 세 번째 변이 유형 개체는 번데기 껍질을 벗어 우화를 하는 데에는 성공했지만 날개가 몸통에 비해 짧게 형성되어 기형으로 발육한 개체도 관찰할 수 있었다.
대조구는 2가지 그룹으로 어떤 것도 주입하지 않는 무처리구 그룹과 DW를 5 μl씩 주입한 그룹 으로 나누었다. 실험한 개체의 인공사료는 생물검정이 모두 완료되는 기간인 처리된 개체가 용화될 때 까지 매일 매일 제공해 주었다. 표현형적 변이를 관찰하기 위해 각 처리구 당 담배거세미나방을 20마리씩 선발하여 실험하였고 3반복으로 실시하였다.
담배거세미나방의 총 RNA를 분리한 다음 NanoDrop을 이용해 농도를 측정하고 1 μg의 template으로 cDNA를 합성하고 primer set를 이용하여 chitinase gene을 증폭하였다. 전기영동의 결과, chitinase gene은 약 700 bp 근처에서 band가 나타났다(Fig. 1).
Chitinase gene의 dsRNA를 담배거세미나방 4령 유충에 주입한 후 시간에 따른 유충의 표현형적 변이를 관찰하였다. 주입 후 6, 12, 18, 24시간마다 각각의 개체 변이를 확인한 결과, 주입 후 6시간째에 주입한 개체의 등쪽 표피에서 색소침적이 덜 된 변이를 확인할 수 있었다(Fig. 6). 주입 후, 18시간째에 탈피각이 몸체의 중간에 걸려 온전히 탈피하지 못하고 있음을 관찰할 수 있었다.
하지만 본 연구의 선행연구결과, 담배거세미나방에서는 5령 유충에 dsRNA를 주입하여도 유전자 발현 억제에 의한 탈피저해 현상이 나타나지 않았다(Date 제시하지 않았음). 주입하는 dsRNA 농도가 적거나 5령에서 번데기가 되기까지의 기간이 파밤나방보다 길어 target gene에 대한 RNAi 효과가 떨어질 수 있을 것이라 예상되었다. 그러므로 본 연구는 담배거세미나방 4령 유충에 dsRNA를 주입하여 5령으로의 탈피, 용화 그리고 우화에 대한 표현형적 변이를 관찰하였다.
4). 첫 번째로 기형발육 개체는 복부 이하의 부분에 비해 유충의 머리와 가슴 부분이 제대로 발육하지 않았으며 두 번째 유형인 탈피저해 현상은 4령에서 5령으로 탈피를 시도할 때 나타났다. 탈피각을 제대로 벗어내지 못해 복부의 중앙에 탈피각이 걸려 더 이상 발육하지 못했다.
그 결과 성충으로 우화시 표현형적 변이 양상은 탈피저해, 날개변이, 기형발육과 같은 3가지 유형으로 나타났다. 첫 번째로 탈피를 저해 받은 개체는 우화 시 번데기 껍질을 제대로 벗지 못해 온전한 성충이 되지 못하고 사망하였다. 그러나 두 번째 변이 유형인 날개 변이 개체는 양쪽 날개가 몸통을 완전히 덮지 못할 뿐 성충으로 우화하는 데에는 큰 영향을 끼치지 않았다.
세번째 변이 유형인 색소변이는 4령에서 5령으로 탈피를 한 뒤 확인할 수 있는 표현형적 변이였다. 탈피 후 불특정하게 색소변이가 일어나 얼룩덜룩한 무늬를 확인할 수 있었다. 또한 탈피저해와 색소변이가 함께 일어나는 경우도 관찰할 수 있었다.
후속연구
또한 injection의 방법으로는 담배거세미나방의 효율적인 방제 효과를 기대하기 어렵다. 따라서 앞으로 injection 외에도 feeding 등의 방법을 모색하여 RNA interference에 대한 연구를 수행되어야 할 것이다.
또한 연속작물의 생산이라든가 화학농약으로 방제가 어려운 경우에는 생물적 방제시스템이 사용되어져야 한다. 종합방제방법에서 생물적 방제 방법의 가능성을 암시하는 이 연구과제는 더욱 전문적으로 검토되어야 할 필요성이 제시되었다.
7). 키틴합성과 관련된 여러 가지 효소와 관련된 각각의 유전자에 대한 RNA interference 효과가 다르게 나타날 수 있으며, 위의 결과를 통해 2가지 이상의 target gene에 대한 RNAi 효과도 기대해 볼만하다. 그러나 곤충의 생리적 특성에 따라 target gene을 선발해야 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Chitin은 균과 곤충에게 어떤 요소인가?
, 2001). Chitin은 많은 종의 진균에서 세포벽과 격막을 형성하는데 필수적인 물질이지만 곤충에 있어서도 외골격을 형성하고 영양위식막 을 형성하는데 필수적인 요소이다(Arakane et al., 2004).
곤충의 Chitin은 무엇으로 구성되었는가?
한편 곤충의 Chitin은 β-(1,4)-N-acetylglucosamine으로 구성된 polysaccharide 이다(Shinoda et al., 2001).
담배거세미나 방은 어디에 분포하는가?
litura, tobacco cutworm or common cutworm)을 본 연구의 방제대상 해충으로 선발하였다. 이 종은 나비목 (Lepidoptera) 밤나방과(Noctuidae) Spodoptera 속에 속하는 난방제 해충으로 아시아, 호주 등에 분포한다. 기주범위가 넓어 채소, 과수, 화훼 등 44과 112종 이상의 작물을 가해하 는 광식성 해충으로 알려져 있다(Garad et al.
참고문헌 (24)
Arakane, Y., D. G. Hogenkamp, Y. C. Zhu, K. J. Kramer, Charles A. Specht, R. W. Beeman, M. R. Kanost and S. Muthukrishnan (2004) Characterization of two chitin synthase genes of the red flour beetle, Tribolium castaneum, and alternate exon usage in one of the genes during development, Insect Biochem. Mole. Biol. 34:291-304.
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