초록 ▼

본 연구과제는 남성의 생식과 종의 영속성에 관여하는 주요 인자인 정원줄기세포를 대상으로 줄기세포 연구분야에서 독특하게 분화양상 및 수적으로 객관적인 지표의 분석이 가능한 정소내 이식 기법과 장기간의 증식이 가능한 배양기법을 사용하여 자가재생산에 관여하는 분자생물학적인 기전을 구명하는데 목적이 있다.
본 연구에서는 정원줄기세포 자가재생산에 가장 밀접한 요인으로 보고되고 있는 Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)와 관련 수용체들과의 상호작용을 분석하기 위한 기반기술로서 정원줄기

본 연구과제는 남성의 생식과 종의 영속성에 관여하는 주요 인자인 정원줄기세포를 대상으로 줄기세포 연구분야에서 독특하게 분화양상 및 수적으로 객관적인 지표의 분석이 가능한 정소내 이식 기법과 장기간의 증식이 가능한 배양기법을 사용하여 자가재생산에 관여하는 분자생물학적인 기전을 구명하는데 목적이 있다.
본 연구에서는 정원줄기세포 자가재생산에 가장 밀접한 요인으로 보고되고 있는 Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)와 관련 수용체들과의 상호작용을 분석하기 위한 기반기술로서 정원줄기세포 특이마커와 MACS 및 FACS 기법을 이용하여 순수도가 증진된 정원줄기세포군을 확보하였고 체외배양 시스템을 최적화하여 기능적으로 안정화된 정원줄기세포의 지속적인 증식체계를 확립하였다. 면역세포화학법 및 RT-PCR을 통하여 배양중인 정원줄기세포에서 GDNF 관련 수용체인 GDNF family receptor alpha 1 (GFRα1), RET, Neural cell adhesion molecule (NCAM)의 발현을 확인하였으며, 배양시 GDNF의 첨가 유, 무에 따른 상기 관련 수용체들의 발현양상을 관찰함으로서 GDNF가 GFRα1, RET, NCAM 수용체들과 밀접한 연관이 있는 것을 검증하였다. 또한 immunoprecipitation을 이용한 단백질 분석 결과 GFRa1과 RET, NCAM 수용체 간의 결합양상을 관찰하였으며 RET 수용체가 NCAM 수용체와 비교하여 GDNF와 강한 결합력을 가지는 것을 확인하였다.
정원줄기세포의 자가재생산에 관여하는 또 다른 GDNF관련 신호전달 기작을 조사하기 위하여 배양 과정 중 GDNF관련 down-stream signaling inhibitors [Phosphoinositide-3 kinase(PI3K), Akt, Src family kinase(SFK), protein kinase C(PKC)]를 처리 하였고 각각의 inhibitor 처리에 따른 체외증식, 분화, 세포자연사 양상 및 생물학적 활성도를 분석하였다. 특히 상기 signaling pathway 중 PKC는 정원줄기세포의 자가재생산과 관련하여 알려진 것이 매우 적기 때문에 PKC의 신호전달기작 억제 효과를 중점적으로 비교분석하였다. 배양 기간 중 PKC inhibitor를 8일간 처리하였을 때 정원줄기세포의 체외증식 능력이 급격히 저하되었으며 배양된 세포의 수도 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 그러나 분화 및 세포자연사 분석 결과에서는 대조군과 비교하여 유의한 차이가 나타나지 않는 것으로 보아 PKC inhibitor를 처리하였을 때 정원줄기세포의 수가 감소하는 것은 배양중인 세포의 분화 및 자연사에 의한 것이 아닌 자가재생산 능력이 감소된 것으로 보여진다. 또한 생체이식기법을 이용하여 정원줄기세포의 생물학적 활성도 분석 결과, PKC inhibitor처리된 정원줄기세포를 이식한 수여동물 정소내에서 대조군과 비교하여 유사한 공여-유래 콜로니가 형성되는 것을 관찰함으로서 PKC inhibitor 처리된 세포군이 기능적으로 이상이 없는 정원줄기세포임을 확인하였다. 결과로서 PKC signaling이 정원줄기세포의 자가재생산에 관여하는 중요한 신호전달 기전임을 검증하였다.

목차 Contents

• 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
• 목 차 ... 3
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 5
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 6
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 7
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 7
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 7
• Ⅲ. 연구성과 ... 8
• 끝페이지 ... 9