초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
□ Mx, IFN-α/β 유전자의 cSNP 발굴 : 한국 재래닭 3계통(흑색, 황갈색, 적갈색)과 국제축산연구소 제공 3개국 재래닭(아프리카 말라위, 방글라데시, 파키스탄) 염기서열 비교 분석을 통한 SNP 좌위 발굴
□ 저병원성 AIV 감염에 의한 차등발현 유전자 발굴을 위한 Tracheal Epithelial Cells Culture 방법 확립 및 anti-viral Gene Transfection : 20일차 수정란에서 기관세포 분리 및 배양체계 구축
□ AI 바이러스 감염 실험에 따른 차등발

Ⅳ. 연구개발결과
□ Mx, IFN-α/β 유전자의 cSNP 발굴 : 한국 재래닭 3계통(흑색, 황갈색, 적갈색)과 국제축산연구소 제공 3개국 재래닭(아프리카 말라위, 방글라데시, 파키스탄) 염기서열 비교 분석을 통한 SNP 좌위 발굴
□ 저병원성 AIV 감염에 의한 차등발현 유전자 발굴을 위한 Tracheal Epithelial Cells Culture 방법 확립 및 anti-viral Gene Transfection : 20일차 수정란에서 기관세포 분리 및 배양체계 구축
□ AI 바이러스 감염 실험에 따른 차등발현 유전자 분석 : Microarray 분석을 통하여 기관지 상피세포에서 AI 바이러스 감염시 차등발현 유전자 탐색
□ 닭의 Busulfan 처리가 불임 유도 및 성세포 발달에 미치는 영향 조사 및 바이러스 저항 후보유전자 도입 닭 정원 줄기세포의 수탉 고환내 이식
□ AI 저항 후보유전자(Mx, IFN-α, -β) cloning, 발현검정 및 발현 세포주 구축
□ Genomics 분석 결과 얻어진 새로운 항바이러스 유전자 및 단백질군의 AI 바이러스에 접종된 세포주를 이용한 기능 검정
□ AI 저항성 조류 품종의 특성 분석
□ 고병원성 조류인플루엔자 공격접종 시험모델 확립

Abstract ▼

Avian influenza virus (AIV) is an enveloped virus from the Orthomyxoviridae family and can be classified as either low pathogenicity (LP) or high pathogenicity (HP). It has an eight-segmented, single-stranded, negative-sense RNA genome. Because of its continuing evolution, AIV is able to modify its

Avian influenza virus (AIV) is an enveloped virus from the Orthomyxoviridae family and can be classified as either low pathogenicity (LP) or high pathogenicity (HP). It has an eight-segmented, single-stranded, negative-sense RNA genome. Because of its continuing evolution, AIV is able to modify its genome by any of the several types of mutations, including antigenic variation, natural selection, and reassortment. Because of this, AIV outbreaks are the cause of serious concern in asian countries. Especially the economic losses incurred in the poultry industry because of H9N2 low-pathogenic avian influenza (LPAI) are extreme, and this infection has been endemic in domestic poultry farms in Korea since 1996.
AIV virus targets the epithelial cells of the upper respiratory tract. The early steps in infection, as well as the pathogenicity of AIV, depend on the cleavage of the haemagglutinin (HA) glycoprotein of AIV. A major route of infection of AIV in chickens is through cells of the respiratory epithelium. Although animal systems (in vivo) are the best systems for studying disease response, we use an in vitro systems (cell lines and organ cultures) that offer the opportunity to study mechanisms of infection and the immediate host responses under highly controlled conditions. Tracheal epithelial cells (TECs) are an important tool for studies of viral respiratory diseases. Primary TECs have been cultured from human, mouse and hamster. It is also necessary to diagnose viral respiratory disease and reveal infection mechanisms in chicken. We isolated tracheal epithelial layers from tracheal of 20-day-old chicks and cultured primary TECs from the isolated layers. Ciliated cells which were a typical morphology of TECs were observed in cultured primary TECs and maintained until cell passage 5 (15 to 20 days). When we analyzed expression patterns of epithelial marker genes (retinoic acid responder, FGF-binding protein, virus activating protease) in TECs compared to immortalized chicken embryonic fibroblast cell line (DF-1), all the marker genes are highly expressed in TECs than in DF-1. After H1N1 virus infection, we found major 20 antiviral genes of differential expression. The relationship between transfected-TEC and H1N1 virus infection was investigated by microarray. We found transfected-TEC had high expression gene related resistance for cell death and immune sensitivity.
As a innate immune protein, the Mx protein is one of the antiviral GTPases, induced by interferon. The Mx system in the chicken has a genetically RNA-virus resistant or sensitive character that provides diversity in response to experimental infections such as with influenza viruses. The innate immune response nonspecifically induces antiviral activities by recognition pathogen-associated molecular patterns. Those are recognized by variable pathogen recognition receptors, and following signal transduction pathway transmits its signal to induce type I IFNs by auto- or paracrine effects. The type I IFNs effect on not only sensitized cell, but also neighbor cells to maintain antiviral states. Finally, IFN-inducing antiviral effectors such as Mx GTPase, PKR, RNase L or OAS are produced and inhibit virus replication.
Host immunity, particularly innate immunity, is important in the pathogenesis of AIV. Since current knowledge on the avian immune response to AIV infection is limited, we used microarray analysis to examine global changes in immune-related gene expression induced by H9N2 virus infection in chickens. We optimized challenge dose and condition of H9N2 and H5N1 viruses in this study. H9N2 virus infection induced strong innate immune responses in brown layer chickens than white layer chicken. The increased transcription of 2′ -5′ -oligoadenylate synthetase, C-type lectin, and myxovirus resistance genes was confirmed by real-time RT-PCR.
In our project, antiviral genes including chicken IFN-α/β/γ, Mx, c-type lectin gene were cloned into mammalian expression vector. Virus replication was inhibited in transiently antiviral gene expressing chicken cells infected with avian influenza. Additionally, we evaluated the resistance of transgenic chicken expressing a 3D8 scFv antibody against H9N2 and H5N1 viruses. Transgenic chickens showed partial resistance against H9N2 infection in this study.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 6
• 목차 ... 8
• 제 1 장 서 론 ... 10
• 1절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 10
• 2절 연구개발의 범위 ... 11
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 13
• 1절 국내 연구 현황 ... 13
• 2절 국외 연구 현황 ... 13
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 14
• 1절 항바이러스 유전자 cSNP 조합 검정, 복합항체 생산 및 형질전환 바이러스 벡터 개발 ... 14
• 2절 닭 기도상피세포 배양방법 확립 및 Genomics/proteomics를 통한 새로운 항바이러스 유전자 탐색 ... 24
• 3절 닭 줄기세포(원시생식, 성체줄기 및 정원줄기세포) 분리 배양방법 확립 및 항바이러스 유전자 도입 ... 42
• 4절 닭 정원줄기세포를 이용한 형질전환 닭 생산 ... 66
• 5절 조류인플루엔자(AI) 저항 후보유전자(Mx, IFN-α/β) cloning 및 발현검정 및 발현 세포주 구축 ... 72
• 6절 AI 저항 후보유전자 단백질 발현 저해 siRNA 발굴 및 활성 검정 ... 78
• 7절 Tracheal epithelial primary cell의 air-liquid interface culture system 개발 ... 78
• 8절 바이러스 감염 세포로부터 추출한 RNA 및 protein의 RT-PCR, Western 분석을 통한 항바이러스성 검정 및 AIV subtype(H1N1, H9N2, H5N1 등) 접종 후 AI 저항 후보유전자(Mx, IFN-α/β) 발현 세포주 저항성 검정 ... 80
• 9절 바이러스 감염 세포로부터 추출한 RNA 및 protein의 RT-PCR, Western 분석을 통한 항바이러스성 검정 ... 92
• 10절 AI 저항후보유전자 Toll-like receptor-3, -7(TLR-3, -7) cloning, 발현검정 및 발현 세포주 구축 ... 94
• 11절 닭 기관 상피세포(chicken tracheal epithelial primary cell)의 air-liquid interface culture system 개발 ... 96
• 12절 AI 저항 후보유전자 chicken IFN-γ cloning 및 발현검정 및 발현 세포주 구축 ... 99
• 13절 바이러스 감염 세포로부터 추출한 RNA의 RT-PCR 분석을 통한 항바이러스성 검정 ... 100
• 14절 AI 바이러스 접종 후 AI 저항 후보유전자 IFN-γ의 발현세포 저항성 검정 ... 101
• 15절 AI 저항 후보유전자 단백질 발현 저해 siRNA 발굴 및 활성 검정 ... 102
• 16절 AI 저항 후보 유전자군의 상호연관성 규명 ... 104
• 17절 Genomics 분석 결과 얻어진 새로운 항바이러스 유전자 및 단백질군의 AI 바이러스에 접종된 세포주를 이용한 기능 검정 I ... 105
• 18절 Genomics 분석 결과 얻어진 새로운 항바이러스 유전자 및 단백질군의 AI 바이러스에 접종된 세포주를 이용한 기능 검정 II ... 111
• 19절 AI 저항성 조류 품종의 특성 분석 ... 113
• 20절 조류를 이용한 AI 저항성 후보 유전자군의 발굴 및 항바이러스성 기능의 생체 내 검정시험 ... 125
• 21절 핵산가수분해 항체를 발현하는 형질전환 닭의 조류인플루엔자 전파 억제능 확인 시험 ... 135
• 제 4 장 연구개발 목표 달성도 및 대외기여도 ... 139
• 1절 : 목표대비 달성도 ... 139
• 2절 : 정량적 성과 ... 143
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 144
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 146
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 148
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 149
• 제 9 장 참고문헌 ... 150
• 끝페이지 ... 153