초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
Beaveria bassiana, Lecanicillium spp을 포함한 47종의 곰팡이 균주를 대상으로한 진딧물 대상 살충력 검정 결과 3일차, 5일차, 7일차 배양액 모두에서 복숭아혹진딧물과 목화진딧물에 대한 살충율은 B. bassiana Bb08 균주가 가장 우수하였고, 3일차 배양액의 경우 각각의 대상해충에 대해 100와 약 70%로 살충률을 나타내었다. 배양여액의 반수치사시간(LT₅₀)을 구한 결과 Bb08균과 Pf109균은 3일, 5일, 10일 배양여액에서 2.6~3.1일 이었

Ⅳ. 연구개발결과
Beaveria bassiana, Lecanicillium spp을 포함한 47종의 곰팡이 균주를 대상으로한 진딧물 대상 살충력 검정 결과 3일차, 5일차, 7일차 배양액 모두에서 복숭아혹진딧물과 목화진딧물에 대한 살충율은 B. bassiana Bb08 균주가 가장 우수하였고, 3일차 배양액의 경우 각각의 대상해충에 대해 100와 약 70%로 살충률을 나타내었다. 배양여액의 반수치사시간(LT₅₀)을 구한 결과 Bb08균과 Pf109균은 3일, 5일, 10일 배양여액에서 2.6~3.1일 이었고, 7일 배양에서 가장 높은 경향을 보였다. 복숭아혹진딧물의 경우 Bb08 균주에 대한 반수치사시간은 2.0일 가장 짧게 나타났다. 상기의 결과를 토대로 B. bassiana Bb08 균주를 유효미생물로 최종 선발하였다. Bb08 균주를 배지 조성 및 pH를 달리하여 배양한 배양여액의 살충력을 확인한 결과, 배양 배지의 pH에는 영향을 많이 받지 않았으나 배지 조성에 따라서는 상당한 영향을 받아 corn steep이 주성분인 배지의 배양여액의 살충율이 다른 배지에 비해 높았다. 또한, Bb08 균주를 곡물에 배양한 분생포자의 물 및 에탄올 추출물과 액체 배양 여액의 진딧물 살충율을 비교한 결과, 분생포자 추출물과 액체 배양여액 간에 살충율 차이가 없어 배양의 편의성을 위해 액체 배양여액을 사용하기로 결정하였고, 포자를 포함하고 있는 배양액의 살충율이 배양여액에 비해 높은 살충율이 높게 나타났다.
배양기간별 살충율 조사 결과, 3일 배양액의 살충율이 5일 배양액보다 높은 것으로 조사되어 이 균의 경제적 배양기간은 3일로 판단되었다. Bb08 균주 배양액과 배양여액은 타 해충인 담배가루이 약충, 꽃노랑총채벌레, 그리고 점박이응애 약충에 대해서도 높은 살충율을 보였으며, 모든 해충에서 포자가 포함된 배양액의 살충율이 높았다. 클로로포름과:메탄올 충진으로 분리 분획별 진딧물에 처리한 결과, 6번 분획의 살충율이 가장 높았으며, 위의 결과로 보아 분획 6번을 중심으로한 부위에 진딧물 살충성 물질이 존재하는 것으로 추정되었다. 실내 pot test 결과 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대해 leaf-disc 생물검정에 비해 낮은 75% 이상 방제 효과를 나타내었으나 식물 생물검정의 결과로 이 균주 배양액 또는 배양여액의 살충제로의 개발 가능성을 보여 주었다.
현미경 관찰을 통한 배양액 처리후 상태 변화를 관찰한 결과 진딧물의 표피가 녹거나 엷어지거나 색이 변화되는 현상이 관찰되었다. 처리 후 경과 일 수에 따라 충체 표면의 적색이 감소하는 것이 관찰 되었으며 무처리와 다르게 표면이 녹아 큐티클이 뭉치거나 엷어지는 현상을 보였다.
곤충 병원성 곰팡이 배양액의 이화학적 특성 및 생리 활성을 검정한 결과에서는 유리당으로는 glucose, maltose, fructose가 검출되었으며, 유기산은 citric acid, malic acid, formic acid, lactic acid, acetic acid, succinic acid등 6종류가 동정되었다. 폴리페놀의 함량은 배양기간이 길수록 증가되었으며, Beauveria bassiana 15일 배양액에서 가장 높은 값을 나타내었다. 플라보노이드 함량 또한, Beauveria bassiana Bb08을 포함한 모든 균주에서 15일 배양액의 효과가 가장 우수하게 나타나 상기 기능성분의 강화를 위해서는 15일 배양액이 최적의 기간으로 사료되었다.
항산화 활성을 세가지 방법으로 측정한 결과 Beauveria bassiana 배양 3일차에서 NO 생성을 가장 높게 억제하였으며, 항암활성을 나타내는 A549 cell lines는 I. fumosorosea 3일 배양액, HepG2 cell lines는 Cordyceps sp. 10일 배양액, MCF-7 cell lines는 I. fumosorosea 5일 배양액이 가장 높은 항암활성을 나타내었다. 상기의 결과 고부가가치의 원료로써도 곤충병원성곰팡이 배양액의 활용도가 충분하리라 판단되었다.
Beauveria bassiana Bb08이 생산하는 살충성 물질의 대량 생산을 위한 최적배양조건(최적온도 26.2℃, pH 5.9, 회전속도 209.0 rpm, 배양시간 5.9일)과 최적배지조건 (Corn meal 3.0%, Corn steep powder 2.8, rice bran 3.2%)을 통계적 방법에 의해 확립되었으며, 이러한 최적배지 및 배양조건을 통해 생산된 배양액의 진딧물 살충율은 5일 후 100%이었다. flask와 fermentor test 에서 모두 CCR배지가 살충물질의 최적 배지로 선정되었으나, 산업화시 배양 후 여과의 어려움이 있어 corn meal 대신 3% corn starch를 대체한 산업화배지를 개발하였으며, 50 L-fermentor 대량 포멘터에서의 검증을 완료하였다. 최종 배양액과 배양여액의 살충율을 확인한 결과 최적화 시스템으로 생산된 배양액은 살포 후 2일째 76.66%, 3일째 살충률 100%으로 나타났고 배양액 여과액(살충대사물)의 경우 살포 후 5일째 살충력 90%, 6일째 살충률 96.66%으로 나타났다.
상기의 결과를 토대로 진딧물 방제용 물질의 제형 개발 연구를 진행하였다. 병원성곰팡이의 효력 증진 보조제 선발을 위해 고삼추출물 및 제충국 2종의 추출물을 대상으로 시험하였고, 경제성이 높은 고삼추출물 5ppm을 선발하였다. Beauveria bassiana Bb08 배양액과 고삼 추출물의 혼합처리는 각각의 단용 처리구(Bb08 배양여액 : 72.1%, 고삼추출물 : 50.8%)보다 높은 82.6%의 방제효과를 보여 10% 이상의 시너지 효과를 확인하였다. 제형화를 위한 보조 선발로는 부착성 증진제(Xanthan gum 0.1%)와 자외선 차단제(RHICHVIN, LOWILITE 62 50ppm)를 선발하였고, 주성분 및 첨가제 혼합에 따른 안정제로 polyoxyethylene dodecyl mono ether(EPA List 4B) 5%를 제품내 첨가하여 유화성을 높였다.
상기의 확인된 결과를 바탕으로 혼합제를 조제하였고, 이를 오이, 배추에 발생되는 진딧물을 대상으로 농도별(250배, 500배, 1000배)로 살충력을 검정하였다. 처리농도에 따른 살충력은 배추복숭아혹진딧물에 대해 250배(91.7%), 500배(86.3%), 1,000배(72.5%)의 방제효과를 나타내었으며, 오이 목화진딧물에 대해서는 250배(97.4%), 500배(88.2%), 1,000배(80.1%)의 살충력을 보였다. 최적 처리농도는 80% 이상의 방제효과를 보인 500배를 선정하였다. 2차년도에는 효율적인 시제품의 처리방법 규명을 위해 처리횟수 및 처리간격을 달리하여 살충력을 확인하였고, 500배 농도로 5일간격 2회 처리하는 것이 가장 효율적인 방제 효과를 나타내었으며, 방제가는 83.2%였다. 화학농약과의 비교 평가에서는 티아클로프리드 액상수화제와 이미다클로프리드 수화제를 대조로 각각 90.8%와 91.9%의 대비 효과를 나타내었다.
시제품의 안정성 평가에서도 어독성 Ⅲ급, 급성경구독성 Ⅳ급, 급성경피독성 Ⅳ급으로 평가되었으며, 급성안막자극지수와 꿀벌독성에서도 안정성이 확인되었다.

Abstract ▼

Aphids are one of the most destructive pests in crop production such as pepper, cucumber, and eggplants. The importance of entomopathogenic fungi as alternative pest control agents is increasing. Conidia of entomopathogenic fungi are influenced by environmental conditions such as temperature and rel

Aphids are one of the most destructive pests in crop production such as pepper, cucumber, and eggplants. The importance of entomopathogenic fungi as alternative pest control agents is increasing. Conidia of entomopathogenic fungi are influenced by environmental conditions such as temperature and relative humidity and cause slow and fluctuation of mortality. These factors are preventing wider application and use of the biocontrol agents. To investigate means to mitigate such problems, we conducted bioassays with 47 fungal culture filtrates to determine if secondary metabolites produced by
entomopathogenic fungi have potential for use in aphid control. Among 47 culture filtrates cultured Potato dextrose broth (PDB), filtrate of B. bassiana Bb08 showed highest mortality (78%) against green peach aphid 3 days after treatments. However, these filtrates have no high control activities against Spodoptera exigua and S. litura and no antifungal effects to fungal plant diseases such as F usarium oxysporum, P hytophthora capsici, R hizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum. Filtrate of Bb08 cultured in Adamek’s medium had higher toxicity as 100% to 3^rd instar nymph of the aphid compared with 7 other filtrates cultured at different broths amended with colloidal chitin or oil. The culture filtrates and fluids from media amended with colloidal chitin or oil had lower control efficacies than filtrates without these additives in three different media. These results indicate that the culture fluid or filtrate of B. bassiana Bb08 cultured at Adamek’s medium has potential for development as a mycopesticide for aphid control.
For the maximal production of aphicidal metabolites produced by the Beauveria bassiana Bb08, optimal culture medium and optimal culture condition were examined. From various culture media tested, CCR (3% corn meal, 2% corn steep powder, 2% rice bran) resulted in the highest cell growth rate and aphid mortality, and therefore was selected as the best medium with economical low cost. To determine optimal culture condition, statistical methods such as Box-Behnken experimental design and response surface methodology (RSM) were used. After the statistical analysis of the aphid mortality, the optimal culture condition was found to be culture temperature of 26.2℃, medium pH 5.9, flask shaking speed of 209.0 rpm, and culture time of 5.9 days. The expected mortality on 4, 5, 6 days after spraying the filtrate to the aphids were 76.8, 84.9, and 89.4%, respectively. All the 4 factors of the culture condition significantly affected the production of the aphicidal metabolites, and the order of significance was temperature, pH, culture time and shaking speed. To improve culture filterability of the culture broth, the corn meal was substituted with corn starch.
It was focused on physico-chemical properties, antioxidant, anti-inflammatory and anticancer activities of enthomopathogenic culture mediums. Glucose, Maltose, Fructose were found in free sugar by the HPLC analysis. Glucose was the most abundant in Cordyceps sp. (15.7 g/L), B. bassiana (15.2 g/L) and I. fumosorsoea (15.9 g/L) of 3 day medium. Various organic acids including Citric acid, Malic acid, Formic acid, Lactic acid, Acetic acid, Succinic acid were assayed by HPLC. Citric acid was observed the highest component in Cordyceps sp. (309.2mg/L) of 10 day medium. The composition of Glutamate was the highest among amino acids of B. bassiana (987.0 pmol/㎕), Cordycesps sp. (1016.8 pmol/㎕) and I. fumosorosea (261.7 pmol/㎕) of 3 day medium. Various minerals including Na, K, Mg, Ca, F, Cl, SO₄, NO₃, and PO₄ were analysised by Dionex ICS3000. Na was the highest among minerals of Enthomopathogenic fungi medium. The highest content of total polyphenol (7.04 ppm) and flavonoid (1.11 ppm) were detected in the Cordyceps sp. of 15 day medium. Generally, the amounts of polyphenol and flavonoid compounds were higher in Cordyceps sp. than B. bassiana and I. fumosorosea.
Regarding anti-inflammatory activity, it was observed that the B. bassiana of 3 day medium, Cordyceps sp. of 15 day medium and I. fumosorosea of 3 day medium extract exhibited the highest nitric oxide (NO) inhibition activities at concentration of 100 ㎍/㎖. Effects of enthomopathogenic culture medium extracts on the viability of human lung cancer (A549), liver cancer (HepG2) and breast cancer (MCF-7) cells were also investigated. I . fumosorosea of 5 day medium extracts exhibited the highest cytotoxicity in A549 cell lines (162.0 ㎍/㎖), Cordyceps sp. of 10 days medium extracts exhibited the highest cytotoxicity in HepG2 cell lines (84.7 ㎍/㎖) and I. fumosorosea of 5 day medium extracts exhibited the highest cytotoxicity in MCF-7 cell lines (115.1 ㎍/㎖). Their effects were found lower than doxorubicin used as control.
To increase entomophathogenic effectiveness of control aphids, extracted matrine and phyrethrum were tested to verify synergistic effect. 5ppm matrine is optimized economically. The optimal mixture of cultured entomophathogenic fungi and matrine was showed 82.6.% higher mortality than 72.1% Bb08 and 50.8% matrine mortality. To optimal formulation, 0.1% Xanthan gum and 50 ppm LOWLITE 62 were selected for the adhesion booster and UV protection. Non-ionic surfactant 5% polyoxyethylene dodecyl mono ether(EPA List 4B) is distinguished by excellent solubility of main ingredient and synergist.
Mixture formulated product according to the result was evaluated the aphids mortality by 250, 500 and 1000 dilutions. 500 dilution fold was showed 80% upper motality that is resulted optimized treatment dilution fold.
For the best way to control aphids by application times and treatment interval second year test was continued. As a result, 500 dilution application of second times and 5 days interval was the best way to control aphids effectively. The mortality was 83.2% and chemical pesticide showed 89.8% and 89.3% motality.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• 목차 ... 10
• 제 1 장 서 론 ... 11
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 13
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 15
• 제 1 절 주요 연구 성과 ... 15
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 82
• 제 1 절 목표대비 대외달성도 ... 82
• 제 2 절 정량적 성과 ... 84
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 85
• 제 1 절 기술개발 성과물 활용 방안 ... 85
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 86
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 86
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 86
• 제 9 장 참고문헌 ... 87
• 끝페이지 ... 98