보고서 정보
주관연구기관 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2014-05 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
과제관리전문기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
등록번호 |
TRKO201400012395 |
과제고유번호 |
1475007523 |
사업명 |
농림축산검역검사기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-07-05
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키워드 |
동물용 생약.제품화.효능평가.
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초록
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최종 연구결과 요약
가. 제1세부과제 : 동물용 생약원료 및 제제의 기준·규격 및 시험방법 설정연구
1) 단방 동물용 생약제제의 기준·규격 및 시험방법 설정(1년차, 2012년)
가) 단방 동물용 생약제제 후보물질의 선정
- 생약제제로서 봉독은 항균작용과 면역 증강작용이 있어 실제 임상영역에서 많이 사용하고 있어(설사증, 유방염, 산통, 관절염 등), 유방염의 치료제로서 항생제를 대신할 수 있는 생약제제는 봉독이 타당하다고 판단되어 본 과제의 단방 생약제제로 선택
나) 봉독의 유방염 치료제로서의 경제성 분
최종 연구결과 요약
가. 제1세부과제 : 동물용 생약원료 및 제제의 기준·규격 및 시험방법 설정연구
1) 단방 동물용 생약제제의 기준·규격 및 시험방법 설정(1년차, 2012년)
가) 단방 동물용 생약제제 후보물질의 선정
- 생약제제로서 봉독은 항균작용과 면역 증강작용이 있어 실제 임상영역에서 많이 사용하고 있어(설사증, 유방염, 산통, 관절염 등), 유방염의 치료제로서 항생제를 대신할 수 있는 생약제제는 봉독이 타당하다고 판단되어 본 과제의 단방 생약제제로 선택
나) 봉독의 유방염 치료제로서의 경제성 분석
- 우리나라에서 임상형 유방염 발생율은 약 5.5%로, 연간 손실액이 유질저하 유량감소, 폐기 우유, 대체우 비용, 치료비용 등으로 약 1100억원에 이르며, 평균 1두당 유방염으로 인한 유량 감소가 10~20%, 우유폐기 19.4%, 진료 및 치료비 11.2%, 노동력 0.5%, 대체우 비용 11.2%로 두당 연간 49만원 정도의 손실을 나타냄. 봉독 구입비용 1mg/300원, 24mg/1일 사용하여 2일간 처리할 시 48mg/분방으로 연 2-3회 유방염이 발생한다 해도 43,200원/분방의 치료 비용이 발생하나 유방염 발생에 따른 분방 당 90,000원보다 저렴하므로 봉독 사용 시 비용 절감 효과가 있음.
다) 봉독을 이용한 제형 개발
- 건조 봉독을 여러 종류의 희석액에(methyl paraben, benzyl alcohol, isoamyl acetate등) 녹인 후 실온(25±℃), 냉장(1~7℃)에서 경시변화에 따른 그 안정성을 평가한 결과 수용액 상태에서의 안정성이 확보되지 않아 동결건조하여 분말화한 봉독을 사용직전에 식염수 희석액에 녹여 사용하는 것으로 제형을 개발하였음.
라) 봉독의 안정성 시험
- 보관 시간에 따른 수용액 및 분말 상태의 봉독의 안전성 시험을 melittin, apamin 및 PLA2을 대상으로 실시한 결과, 동결건조 상태에서는 가속시험조건에서도 6개월 동안 함량이 유지되어 봉독분말은 냉장 및 상온 조건에서 최소 유통기한을 2년으로 설정할 수 있는 안정성이 확인됨.
마) 선정된 단방 동물용 생약제제 기준·규격 및 정량시험법 설정
- 봉독 함량의 50~60%를 차지하는 펩타이드류(melittin, apamin) 및 효소류(phospholipase A2)의 최적분석조건 확립을 위해 9종의 컬럼을 비교분석 및 trifluoroacetic acid/ACN을 gradient 조건 등을 변화시켜 HPLC를 이용한 최적분석조건을 확립함
- 확립된 분석법에 대한 검증(validation) 결과 직선성의 r2>0.999, 각 물질별 정량한계는 apamin 0.796 ㎍/㎖, PLA2 1.399 ㎍/㎖, melittin 3.451 ㎍/㎖이며, 정밀도(precision)의 RSD 4.20% 이하, 정확도(accuracy)는 99.62 ~ 99.40%였으며 RSD 4.85% 이내로 양호한 수준이었음.
바) 패턴분석(성분프로파일링) 및 상관계수
- 봉독의 패턴비교(성분프로파일링)를 생약 가이드라인(안)에 따라 수행하여 표준 크로마토그램을 작성하고, 수입산 봉독 시료 23개(2 lot), 국내산 봉독 6개(3 lot)에 대하여 상관계수를 구한 결과 가이드라인에서 권고하는 0.9 이상이 확인됨.
- 국내산 봉독의 경우 계절별/지역별로 성분 함량의 유의한 차이는 나타나지 않았으며, 수입산 봉독의 경우 성분프로파일링 대상 물질의 함량이 국내산 봉독에 비해 절반 정도 수준으로 나타났으나, 성분 프로파일링 대상 물질의 함량과 봉독의 항균력 사이에는 상관성이 나타나지 않았음.
2) 복방 동물용 생약제제의 기준·규격 및 시험방법 설정(2년차, 2013년)
가) 닭 구포자충 속의 원충감염에 치료 효과가 있는 복방 동물용 생약제제 후보물질로 오레가노 오일과 지유를 선정함. 오레가노 추출오일은 사료 첨가시 육계에서의 생산성 향상 및 콕시듐증상 완화와 장내 대장균 증식 억제효과가 있음이 보고됨. 지유는 국내 산야에 나는 다년초로 급 • 만성 대장염에 효능이 뛰어나며, 지혈 효과가 알려져 있어 콕시듐에 의한 소화기증상 및 2차 세균감염의 완화효과가 기대됨.
나) 선정된 복방 동물용 생약제제의 각 원료별 기준·규격 설정 및 확인, 정량시험법을 개발하였으며, 이에 대한 검증시험을 수행하였음. 오레가노 추출오일(10%)의 분석법 검증 결과 주성분인 티몰과 카바크롤의 분리도는 5.333, 정량곡선의 농도와 피크면적간의 상관계수가 0.99이상(티몰 0.99303, 카바크롤 0.99747), 각각의 정량한계(티몰 12.5㎍/㎖, 카바크롤 2.1㎍/㎖)와 검출한계(티몰 4.1 ㎍/㎖, 카바크롤 0.7 ㎍/㎖), 회수율, 정확성 및 정밀성이 모두 양호함을 확인. 지유 추출물의 분석법 검증 결과 주성분인 gallic acid와 (-)epicatechin을 방해 피크없이 분석하여, 정량곡선의 상관계수 0.99이상(gallic acid 0.99826, (-)epicatechin 0.99967), 정량한계(gallic acid 0.1859㎍/㎖,(-)epicatechin 0.0701㎍/㎖)와 검출한계(gallic acid 0.0613㎍/㎖, (-)epicatechin 0.0231㎍/㎖) 및 회수율(98.36 ~ 101.97%), 정확성(RSD= <2%) 및 정밀성(CV= <1.1%)이 모두 양호함을 확인함.
다) 오레가노 오일과 지유 수용액 추출물 복방 동물용 생약제제의 균일한 제형 개발을 위해 부형제로 유화제를 사용하였으며, 균일한 액상제조가 가능한 비율을 확인함. 주요유효성분의 비율이 가장 높은 수준으로 포함될 수 있도록 복방제제의 최종제품의 조성 및 제형을 결정하였음.
나. 제2세부과제 : 동물용 생약제제의 임상평가 및 제품화 모델제시 연구
1) 단방 동물용 생약제제의 임상평가 및 제품화 모델 제시(1년차, 2012년)
가) In vitro 상의 효능 테스트
- Disc assay, 원통평판법으로 S. aureus에 대한 봉독의 항균력을 확인 확인하였으며, 건조봉독 처리 후 전자현미경으로 관찰 해본 결과 대조군에 비해 세포막의 파괴 및 변형으로 인한 세포 내용물의 용출 및 균수 감소를 확인하였음.
- 봉독의 주요 성분에 대해 항균력 확인시험 결과 melittin의 항균력이 봉독과 동일하게 나타나 melittin이 용균작용 또는 사균 작용과 연관이 있음을 확인하였으나 농도 의존적변화는 관찰되지 않음.
- 국내산 및 수입산 봉독의 국내 유방염 분리균주에 대한 MIC(최소억제농도)는 E.coli에 대해서는 62.5와 250 ㎍/ml로 상이하였고, S.aureus(62.5 ㎍/ml)와 CNS (62.5 ㎍/ml)에 대해서는 동일한 수준이었음. S. marcescens, K. pneumoniae, P. aeruginosa 와 C. freundi에 대한 MIC는 국내산과 수입산 모두에서 >500 ㎍/ml으로 항균력이 인정되지 않음.
- 보관기간 변화에 따른 in vitro 항균력 변화를 확인하기 위해 6주간 보관하며 안정성 시험을 수행하여 시간 경과에 따른 항균력의 감소는 미미함을 확인함.
나) 치료용량설정
- 봉독의 치료용량 확인을 위해 유방염에 걸린 도태 예정우를 선발하여 정상 분방과 임상형 유방염에 걸린 분방에 6, 12mg을 각각 주입하고 임상증상(분방의 경결감, 발적, 열감, 동통 등), 체세포수, 세균수, 균분리동정, 유즙중 백혈구 수 측정함.
- 유방염에 이환된 분방에서 6mg 투여 시 임상증상의 개선이 관찰되지 않았으나, 12mg 투여군에서는 임상증상 개선(부종 및 동통이 완화)과 체세포수 감소가 관찰되어 투여 농도를 12 ㎎으로 결정함.
다) 급성독성시험
- 봉독의 반수치사량(LD50)은 마우스에서 4.3 mg/g(IV), 4.3 mg/g(IP), 41.6 mg/g(SC)으로 확인되었고, 랫드 수컷에서 31.49mg/100g B.W., 암컷 25mg/100g B.W. 로 조사됨.
라) 동물임상실험
- 전북 임실 및 순창 지역에서 50~100두 규모를 착유하고 있는 3개 낙농가 선정하여, 투여 경로로 유두침을 이용하여 임상시험을 수행함.
- 사전시험에 따라 1회 투여용량은 12mg으로 고정하고, 1일 2회 2일 투여군, 1일 1회 4일 투여군, 1일 1회 7일 투여군의 비교시험 결과 1일 1회 7일 투여군에서 유방염 임상 증상 개선 효과가 가장 확실히 인정되어 이를 투여회수 및 기간으로 결정하였음.
- 도출된 용법용량에 따라 총 13두의 유방염 이환우에 투여하면서 14일간 착유한 우유 중 체세포수, 세균수, 유즙내 백혈구수, 임상증상 등을 관찰하고 균분리 및 동정을 수행하였음.
- 13두에서 동통, 부종, 열감 등 임상증상이 완화 또는 소실됨이 확인되었고, 체세포수는 치료전 3×106 ~ 5×106 에서 봉독 투여 종료 시점인 7일째에 1.5×106, 투여종료 후 14일째 2.0×105 이하로 감소함을 확인함. 원유 중 유방염 원인균은 7일째부터 분리되지 않음을 확인함.
2) 복방 동물용 생약제제의 임상평가 및 제품화 모델 제시(2년차, 2013년)
가) 복방 동물용 생약제제의 실험실내 시험에서의 효능평가를 위한 in vitro 상에서의 장내 세균에 대한 효능 테스트 결과 오레가노 오일이 S. aureus (MICs: 0.125~0.25%), E. coli(MICs: 0.125~1%), Sal. enteritidis(MIC: 1%)의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 지유 추출물은 4.8~9.6%에서 S. aureus 를 억제함을 확인함.
나) 복방 동물용 생약제제의 임상 효능평가를 위해 유효성 평가를 위한 시험군의 설정 및 시험방법, 단방 및 복방제제의 비교시험, 3개 농장을 대상으로 한 농장 내 유효성 평가시험과 설치류 및 비설치류를 대상으로 LD50를 산출하기 위한 독성시험 시험을 실시 중임.
다) 복방 동물용 생약제제의 콕시듐에 대한 예방적 효과 확인을 위해 실험실 내 유효성평가 시험을 수행하고 결과 분석 중임.
Abstract
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Title (1st subtitle):
Incorporation of alternative medicines within the animal therapeutic medicine system, it is required for establishment of standards for quality control. In this study, validation of a efficient qualitative and quantitative high-performance liquid chromatography (HPLC) method
Title (1st subtitle):
Incorporation of alternative medicines within the animal therapeutic medicine system, it is required for establishment of standards for quality control. In this study, validation of a efficient qualitative and quantitative high-performance liquid chromatography (HPLC) method was developed and validated for ingredients from bee venom and herb complex. Apamin, PLA2, melittin from bee venom were analyzed by HPLC and -Two components of oregano oil -thymol and carvacrol were analyzed by Gas Chromatography- Flame Ionization Detector (GC-FID) as the index components. Futher active ingredients - gallic acid and (-) epicatechin from one of the herb complex which is called S.officinalis were examined by HPLC. The results from analysis indicated that active substances are in good agreement with the declared content. The proposed HPLC and GC method could be used for routine analysis.
Title (2nd subtitle):
Bovine mastitis is one of the most problematic bacterial diseases in the dairy industry. Antibiotic therapy continues to play an important role for treatment. However, appearance of resistant bacteria causes therapy failure and triggers the exploration of alternative therapy for the bovine mastitis. In Korea, honey bee (Apis mellifera, L) venom therapy (apitherapy) has been elucidated therapeutic value for farm animals with bacterial diseases and reported to be as effective as antibacterial drugs. However, there is few report about honey bee venom application for alternative treatment of clinical bovine mastitis in Korea.
This study was carried out to evaluate the antibacterial activity of honey bee venom against the bacterial mastitis pathogens isolated from Korean dairy farms.
In this study, the concentration of three major active components had a little frustration among three venom products, but the antimicrobial activities were not different statistically. It was clearly demonstrated that the honey bee venom inhibited the growth of seventeen Gram positive bacteria strains and two gram negative strains isolated from bovine mastitis in Korea. However, the pore forming on cell membrane wasn't observed by using bee venoms and sensitive Gram positive bacteria. It is needed to undergo more experimental investigation to ascertain the mechanism of action of antimicrobial activity of bee venom.
목차 Contents
- 연구과제 최종결과보고서 ... 1
- I. 연구배경 및 목표 ... 5
- 1. 연구배경 ... 5
- 2. 연구최종목표 ... 6
- 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
- II. 연구방법 및 수행전략 ... 6
- 1. 재 료 ... 6
- 2. 연구전략 및 방법 ... 7
- III. 연구결과 ... 10
- 가. 제1세부과제명 : 동물용 생약원료 및 제제의 기준·규격 및 시험방법 설정연구 ... 10
- 나. 제2세부과제명 : 동물용 생약제제의 임상평가 및 제품화 모델제시 연구 ... 19
- IV. 연구결과요약 ... 29
- 가. 제1세부과제 : 동물용 생약원료 및 제제의 기준·규격 및 시험방법 설정연구 ... 29
- 나. 제2세부과제 : 동물용 생약제제의 임상평가 및 제품화 모델제시 연구 ... 30
- V. 고 찰 ... 31
- VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 32
- VII. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 32
- VIII. 주요연구과제 변경사항 ... 32
- IX. 참고자료 ... 33
- X. 영문초록 ... 33
- 끝페이지 ... 34
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