보고서 정보
주관연구기관 |
경원대학교 한의과학대학 |
연구책임자 |
황귀서
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참여연구자 |
김기현
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-08 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400017507 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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키워드 |
골다공증.한약재.조골세포.파골세포.세포배양.osteoporosis.herbal medicine.osteoblast.osteoclast.cell culture.
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초록
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본 연구의 목표는 한약재로부터 골다공증에 효과적인 약물 개발과 효과적인 처방 개발에 있다. 본 연구과제는 2개의 연구과제로 구성되어 있으며, 제1세부과제에서는 골다공증에 효과적인 한약재로부터 유효한 물질을 개발하기 위한 연구를 위해 in vitro 실험을 수행하였고, 제2세부과제에서는 한약재 또는 한약처방추출물을 이용하여 랫드에 유발시킨 골다공증에 효과적인지를 평가하는 in vivo 실험을 수행하였다.
제 1 세부과제에서는 한약재로부터 조골세포(osteoblast) 분화에 효과적이며, 파골세포(osteoclast)의 기능을 억
본 연구의 목표는 한약재로부터 골다공증에 효과적인 약물 개발과 효과적인 처방 개발에 있다. 본 연구과제는 2개의 연구과제로 구성되어 있으며, 제1세부과제에서는 골다공증에 효과적인 한약재로부터 유효한 물질을 개발하기 위한 연구를 위해 in vitro 실험을 수행하였고, 제2세부과제에서는 한약재 또는 한약처방추출물을 이용하여 랫드에 유발시킨 골다공증에 효과적인지를 평가하는 in vivo 실험을 수행하였다.
제 1 세부과제에서는 한약재로부터 조골세포(osteoblast) 분화에 효과적이며, 파골세포(osteoclast)의 기능을 억제하는 물질을 개발하려는 목표로 연구가 계획되었다. 이러한 목표를 달성하기 위하여 한약재를 추출, 분획 및 분리하는 화학연구부와 각 분획으로부터 단일물질을 추적하는데 필요한 생리활성부로 나누어 상호 연계되는 연구를 계획하였다. 연구과정은 먼저 조골세포 분화 및 작용을 증가시키는 효능을 가지는 한약재를 찾는 일로 이루어 졌으며, 활성이 있는 것으로 확인된 한약재중에서 산형매립초, 어성초(이하 X라 함)를 MeOH로 추출하고 분획하였으며, 유효분획이 rat calvarial cell 및 bone marrow stromal cell 에 미치는 영향에 대하여 검색하여 조골세포분화를 증가시키는 성분을 추적하였다. 이중 Ethylacetate 분획층(이하 XE)에서 osteoblast cell 분열을 촉진하는 작용을 가진 화합물을 추출물 분획과 컬럼조작을 통해 분리하였으며, 계속하여 NMR, MASS, IR등을 통하여 구조를 결정하는 한편, 분리된 분획 및 compound를 이용하여 골형성세포 및 관여하는 인자들에 대한 활성 검색과 골흡수 세포 및 관여하는 인자들에 대한 활성을 검색하였다. 세포에 대한 효능을 확인한 후, 계속하여 신호전달에 관여하는 부분의 연구를 진행하여 bone matrix 합성, ALP 활성발현, nodule 형성, PCK, PKA등에 미치는 영향등을 검색하여 작용기전의 일부를 밝혔다. 또한, 두개골세포(FCS)와 비장세포의 coculture를 통하여 osteoclast로의 분화에 미치는 영향 및 bone resorption에 미치는 영향, osteoblast로부터 생성되는 osteoclast에 영향을 미치는 관련인자들에 대한 검색을 실시하였다. 연구결과를 요약하면 다음과 같다.
- 한약재 여성초(X) 추출물을 분획과 컬럼조작을 통하여 단일물질로 분리하였다. EtOAC 분획(XE)에서 골세포에 영향을 주는 물질로 compound A, B를 분리하였고, 산형매립초에서는 compound C를 분리하였으며, NMR, Mass 등을 이용하여 분자구조를 밝혔다.
- 분획 XE, XEIII, XEIV와 compound A, compound B, compound C는 BMSC의 분열과 활성을 증가시켰다. 또한, FCS에서 분화를 유도한 경우, ALP의 활성과 nodule 생성능을 증가시켰다.
따라서, 이들 약물은 osteoprogenitor cell이 pre-osteoblast나 osteoblast로 분화를 촉진하고, 그 활성을 증가시킬 것이라 사료된다.
- Compound A와 Compound B는 FCS의 배양초기 PKA와 PKC의 활성을 증가시켰으나, 배양후기의 FCS, 분리정제된 PKA, PKC 에는 영향을 주지 못하였다. 그러나, 배양후기의 FCS에 대하여 ALP의 활성과 collagen의 합성을 증가시켰다.
- XE 및 compound A, B는 이미 분화된 osteoclast를 dentine slice에 이식하여 생성되는 resorption pit 숫자를 감소시키지는 못하였으나, FCS와 spleen cell의 coculture시 분화되는 osteoclast에 의해 발현된는 TRAP 활성은 억제하였다.
- 이 물질들은 osteoblast 로부터 IL-6 생성을 억제하지는 못하였으나, PGE2 생성은 억제하였다.
또한, PGE2를 첨가하여 증가된 osteoclast에 의해 발현되는 TRAP 활성을 억제하였다. 따라서, PGE2 생성 억제를 통하여 osteoclast 분화를 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.
제2세부과제는 조골세포 증식효과가 있는 것으로 제1세부과제에서 확인된 추출물분획이 실제로 골다공증에 유효한지를 평가하기 위한 in vivo 연구를 수행하기로 계획되었다. 이러한 목표를 달성하는 방편으로 난소를 제거하여 유발된 estrogen 결핍성 골다공증 랫드 모델과 prednisolone 투여로 유발시킨 골다공증 모델에 각각 한약재 추출물 및 추출분획을 투여하여 골량에 미치는 영향에 대하여 검색하였으며, 조직화학적 관찰를 통하여 검색하였다. 또한, 조골세포기능과 파골세포기능을 나타낼 있는 생화학적인자들에 대한 검색을 시행하여, 실제로 생체내에서 나타날 수 있는 효과를 알아보았다. 즉, 골밀도에 미치는 영향, Ca, Mg, Pi등 골의 무기질 성분에 미치는 영향, osteocalcin, ALP등 골 형성에 관련된 인자들에 대한 영향, hydroxyproline등 골 재흡수에 관련된 인자들에 미치는 영향등에 대하여 검색하였다.
연구결과를 요약하면 다음과 같다.
- 분획 XE는 난소적출 골다공증 모델 랫드와 prednisolone 투여 골다공증 모델 랫드에서 골밀도와 골무기질 밀도를 증가시켰고, 골내의 Ca, Mg, Pi의 농도도 증가시켰다.
- 분획 XE는 난소적출 골다공증 모델에서 증가되는 골흡수 지표인 뇨중 hydroxy-proline의 농도를 감소시켰으며, 골 형성 지표인 혈중 ALP와 osteocalcin의 농도를 증가시켰다. 이러한 결과는 estrogenic effect와는 관련이 없는 것으로 판단되었다. 또한, prednisolone로 유발된 골다공증 모델에서 감소되는 골 형성 지표 osteocalcin을 증가시켰다. 다라서, XE는 골형성을 촉진하여 골 밀도를 개선할 수 있을 것으로 사료되며, 이러한 결과는 제 1 세부과제의 결과와 일치된다.
이상의 연구결과, 연구에 사용된 산형매립초에서 분리한 compound C는 조골세포의 분화를 촉진하였으며, 어성초 추출분획(X, XE, compound A, B)은 조골세포의 작용 증가와 파골세포의 작용 억제를 통하여 항골다공증 효과를 나타내는 것으로 판단되었다. 계획된 연구목표는 달성된 것으로 사료된다.
Abstract
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In this studies, we aimed to isolate the effectiw substances from herbal medicine and to develop the new antiosteoporotic agents. To achieve this goal, the following experiments were designed and results were followed:
The first subproject - Some herbal extracts(Houttuynia cordata, Chimaphilia um
In this studies, we aimed to isolate the effectiw substances from herbal medicine and to develop the new antiosteoporotic agents. To achieve this goal, the following experiments were designed and results were followed:
The first subproject - Some herbal extracts(Houttuynia cordata, Chimaphilia umbellata) increased the fetal calvarial cell proliferation and bone marrow stromal cell proliferation.
Fractionatio,n on herbal extracts was done to find out of potent fraction and active principles. Ethylacetate fraction(XE) f Houttuynia cordata(X) was more potent than butano(XB) and aQuous fraction(XW). Three compounds were identified in this fraction.
One of them was new compound and others were not.
The mechanism of augumentory effects of XE, XEIII and XEIV on osteoblast proliferation were invested. Collagen, bone martrix, svnthesis was increased in fetal calvarial cell(FCS) by these mixtures or active principles. Alkaline phosphatase expression and nodule formation was also increased in FCS cultured with them. Protein kinase C(PCK) and protein kinae A(PKA) were augumented in early stage of FCS culture by compound A and compound B. But, they did not show any changes in late stage of FCS culture.
XE, XEIII and XEIV did not decrease the numbers of pit formed by osteoclast on dentine slice But tartarate-resistant acid phosphatase(TRAB) activity and PGE2 stimulated-TRAP expression were inhibited in FCS and spleen cell coculture system. PGE2 production from osteoblast was also inhibited by them. It suggested that they might inhibit osteoclast differentiation and bone resorption.
The second subproject- in vivo study on the effect of herbal extract and its solvent fraction. XE increased bone density and bone mineral density in ovariectomized osteoporetic model, and also increased in prednisolone induced osteoporetic model.
Osteocaicin, parameter of bone formation, in serum \vas augumented and hyroxy-proline excretion in urine was decreased by XE.
From these results, it is concluded that inhibitory effect of herbal extracts(X) and its extract fraction on osteoporosis resulted from augumentation of osteoblast proliferation and inhibition of osteoclast differentiation.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 목차 ... 3
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
- Project Summery ... 6
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 16
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 18
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 21
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 26
- 6. 첨부서류 ... 27
- 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 54
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 55
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 56
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 65
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 122
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 129
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 132
- 7. 참고문헌 ... 133
- 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 135
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 136
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 137
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 141
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 233
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 237
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 239
- 7. 참고문헌 ... 240
- 끝페이지 ... 241
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