초록 ▼

유전자 치료를 위하여 널리 연구되고 있는 AAV (adeno-associated virus)는 비병원성이고, 숙주세포의 범위가 넓으며, 숙주 세포내의 유전자 속으로 바이러스 DNA를 삽입시킬 수 있어 장기간 치료 유전자를 발현 (Jong-tenn gene expression)을 유도할 수 있으므로, 유전성 질환이나 종양등의 난치성 질환을 치료하는데 유용한 벡터이다. 그러나, AAV를 이용한 유전자 치료를 실용화 하는데 가장 큰 문제점은 높은 titer의 바이러스 입자를 효과적으로 얻지 못하는 것이다. 재조합 AAV (recombin

유전자 치료를 위하여 널리 연구되고 있는 AAV (adeno-associated virus)는 비병원성이고, 숙주세포의 범위가 넓으며, 숙주 세포내의 유전자 속으로 바이러스 DNA를 삽입시킬 수 있어 장기간 치료 유전자를 발현 (Jong-tenn gene expression)을 유도할 수 있으므로, 유전성 질환이나 종양등의 난치성 질환을 치료하는데 유용한 벡터이다. 그러나, AAV를 이용한 유전자 치료를 실용화 하는데 가장 큰 문제점은 높은 titer의 바이러스 입자를 효과적으로 얻지 못하는 것이다. 재조합 AAV (recombinant AAV) 입자는 특정 유전자가 도입된 AAV-ITR 플라스마드와 AAV의 복제와 입자화에 관계하는 AAV Rep/Cap 유전자를 가진 플라스미드를 cotransfection 시킨 후 헬퍼아데노 바이러스를 감염시켜서 얻는다. 이 방법으로 293세포 한개당 약 0.1-10 개의 rAAV 입자를 통상적으로 얻을 수 있다. 또한 AAV 복제를 위해서 아데노바이러스 등의 헬퍼 바이러스(helper virus)의 감염이 필요한데, 이러한 헬퍼 바이러스를 제거하고 재조합 AAV 만을 분리하는 과정에서 rAAV의 또한 손실이 따른다. 이와 같이 rAAV 벡터를 이용한 유전지 치료 실용화기술에 가장 시급한 문제인 고효율의 rAAV 입자를 얻기 위해서 rAAV의 복제 및 입자화에 필요한 분자생물학적 소재 및 rAAV 입자 생산 기법에 관한 연구를 수행하였다. 그 결과 첫째, AAV RepCap유전자가 아데노바이러스 유전체에 함유된 플라스미드 rAAV 제작용 미니 헬퍼플라스미드 (pCI)가 제작되었다. 이 pCI를 AAV ITR-GFP 플라스미드와 함께 293 세포주에 cotransfection 시켰을 때 rAAV-GFP생산을 효과적으로 유도하였다. pCI는 치료용 유전자가 도입된 rAAV 입자를 만들 때 유용하게 활용될 수 있다. 둘째, AAV Capsid 유전자가 도입된 AAV / Ad hybrid virus (Ad.Cap)가 제작되어 AAV Capsid 단백질틀 VP1, VP2, VP3 단백질들이 발현되는 것을 확인하였다. Ad.Cap 바이러스는 AAV DNA복제 및 입자 생산에 헬퍼바이러스로서 기능할 수 있음을 실험적으로 제시하였다. Ad.Cap 바이러스는 AAV DNA 복제에서의 역할규명 및 시험관 내에서 rAAV 입자를 만들 때에 활용될 수 있다. 셋째, Rep52/40 및 Capsid 발현벡터, 이들이 발현되는 세포주들이 제작되어 이들이 rAAV 입자생성에 미치는 효과를 조사하였다. 비록 Rep52/40 혹은 Capsid 발현 벡터 및 이틀을 발현하는 세포주가 rAAV 입자 생산향상에 큰 효과는 없었지만 이들은 AAV DNA 복제기전 규명, 생활주기의 이해에 유용한 생물학적 소재가 될 수 있다. 넷째, Idodixanol 및 heparin agarose chromatography를 이용하여 rAAV 입자를 분리정재하는 기법을 확립하였고, 이 방법은 rAAV 벡터를 이용한 유전자 치료의 전임상 및 임상실험용 재조합 AAV 입자 생산에 활용될 수 있다.

Abstract ▼

A gene delivery system derived from the adeno-associated virus type 2 (AAV2) has gained ever-increasing attention as an alternative to the more established retrovirus and adenovirus. AAV2 is a naturally defective parvovirus that requires coinfection with a helper virus, such as adenovirus or herpes

A gene delivery system derived from the adeno-associated virus type 2 (AAV2) has gained ever-increasing attention as an alternative to the more established retrovirus and adenovirus. AAV2 is a naturally defective parvovirus that requires coinfection with a helper virus, such as adenovirus or herpes virus, to establish a lytic infection. In the absence of helper virus, AAV2 integrates into the host cell genome at a preferred site within chromosome 19. The virus contains a 4.7 kb single-stranded genome. The genome encodes non structural proteins such as Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40, and capsid proteins such as VP1, VP2, and VP3. The Rep proteins and capsid proteins are required for replication and encapsidation of the viral genome, respectively. Two identical inverted repeats (ITH), which are located at both ends of the genome, are necessary in cis for replication, integration, packaging, and rescue of the genome. rAAV2 is an attractive gene-transfer vector for several reasons. Wild type rAAV2 has n'ot been associated with any diseases in humans. rAAV2 vector does not encode the viral gene and consequently does not elicit a cellular immunity prominently, allowing long-term expression of therapeutic genes in immunocompetent animals. rAAV can transduce dividing and nondividing cells such neuron, hepatocyte, and muscle cells.
A major limitation for the use of AAV2 gene transfer vector in clinical gene therapy protocols is the difficulty of producing high-titer rAAV particles. A standard protocol for generation of rAAV particles involves cotransfection of cells with a vector DNA (AAV ITR plasmid containing therapeutic gene) and a helper plasmid encoding Rep and Cap genes without ITR followed by an infection with adenovirus. This method yields only 0.1-10 rAAV particles per cell. A number of rAAV production methods such as three plasmids cotransfection have been developed. However, an efficiency of the r AAV production yield has still remained a major limiting factor in the use of rAAV for gene therapy of human diseases. This study was performed to develop a molecular and cellular means for the generation of rAAV particles in high-titer. First, we constructed a mini-helper plasmid (pCl) encoding adenoviral genome and the rep/cap genes of AAV. A cotransfection of pCI with AAV ITR-GFP plasmid into 293 cells appears to yield rAAV particles more efficiently than any other methods. Second. replication-defective recombinant adenovirus encoding the cap genes of AAV (Ad.Cap) was constructed. Ad.Cap virus-infected 293 cells produced VP1, VP2, and VP3 proteins abundantly. Ad.Cap functioned as a helper virus for AAV DNA replication. However, we could not detect an increase of rAAV titer per cell when Ad.Cap virus was used as a helper virus compared with wt adenovirus. Yet, Ad.Cap can be used to investigate a role of capsid proteins in AAV encapsidation and be a useful resource to develop in vitro rAAV packaging system. Third, mammalian expression vectors encoding Rep52/40 or the cap genes and stable cell lines expressing these genes were constructed. Although these cell lines did not contribute to yielding rAAV particles in high-titer, these cell lines will be used to further improve an efficiency of rAAV production. Finally, we established a purification method of rAAV particles using iodixanol density centrifugation and heparin-agarose chromatography. The production and purification method of rAAV particles established by this study can contribute to exploiting- rAAV vector for gene theraov of human diseases.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 6
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 9
• 3. 연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 14
• 4. 연구개발과제의 연구고찰 및 결론 ... 32
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 39
• (1) 학술지 게재 ... 39
• (2) 학회발표 ... 40
• (3) 학위논문 ... 40
• (4) 산업재산권 ... 40
• (5) 가타 연구성과 ... 41
• (6) 연구개발과제의 목표달성도 ... 41
• 6. 연구개발과제의 활용계획 ... 42
• (1) 연구종료 2년후 예상 연구성과 ... 42
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 42
• 7. 첨부서류 ... 43
• 8. 참고문헌 ... 44
• 끝페이지 ... 46