초록 ▼

신약개발에 있어서 대사와 체내동태 연구의 역할은 점점 증대되고 있으며 특히 개발 초기 단계에서의 인체조직을 이용한 약물대사와 체내동태 예측은 보다 효과가 우수하고 안전한 약물 개발을 위하여 반드시 수행되어야 한다. 본 연구에서는 이를 위하여 대사 profling, 대사체 구조 규명, 효소억제기전과 약물 상호작용, 그리고 체내동태 예측에 관한 연구를 하였다. DDB를 human liver microsomes과 반응시 3.8-7.2 nmol/mg protein/min으 속도로 대사되었으며 5개이상의 대사체를 생성하였다. 대사에 관여하는

신약개발에 있어서 대사와 체내동태 연구의 역할은 점점 증대되고 있으며 특히 개발 초기 단계에서의 인체조직을 이용한 약물대사와 체내동태 예측은 보다 효과가 우수하고 안전한 약물 개발을 위하여 반드시 수행되어야 한다. 본 연구에서는 이를 위하여 대사 profling, 대사체 구조 규명, 효소억제기전과 약물 상호작용, 그리고 체내동태 예측에 관한 연구를 하였다. DDB를 human liver microsomes과 반응시 3.8-7.2 nmol/mg protein/min으 속도로 대사되었으며 5개이상의 대사체를 생성하였다. 대사에 관여하는 효소는 marker activity와 correlation, immunoinhibition, chemical inhibition, 그리고 정제 P450효소에서의 대사 규명 방법으로 확인한 결과 CYP3A4는 주로 demethylenation 반응을 통한 M1, M2, 그리고 M5형성에 관여하고, CYP1A2는 O-dealkylation에 반응을 통한 M4 형성에 관여함을 입증하였다. M4의 경우는 CYP1A2와 CYP3A4가 동시에 관여하였다. DDB가 human P450 효소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 lsozyme 특이적인 기질을 이용 하여 시험한 결과 CYP3A4활성을 특이적으로 억제하며 Ki 값은 0.314 uM 로 나타났다. CYP2C9 활성도 억제하나 IC50 값이 50 uM 이상이었으며 그외의 CYP2D6등 isozyme에는 영향을 미치지 않는 것으로 판명되었다. 억제 기전으로 DDB를 NADPH와 preincubation하면 반응시간과 농도에 따라 감소하는 inactivation 현상을 보여주었으며 kinact는 0.037min^-1 그리고 Ki는 8.69 uM로 계산되었다. 이러한 enzyme inactivation은 DDB의 methylenedioxy group의 대사 중간체에 의하여 quasi-irreversible complex가 형성되어 일어날 수 있으며 이는 전형적인 456 nm에서 최대흡광도를 보이는 complex를 형성이 농도의존적으로 생성된다는 결과로 입증하였다. Complex 형성에 의한 P450 양의 감소현상도 농도의존적으로 관찰되었다. DDB를 200 mg/kg 용량까지 투여후 혈중농도에서 saturation을 관찰하였으며 이는 I효소 nactivation 에 기인된다고 사료된다. CYP3A4 에 의하여 대사되는 midazolam, terfenadine, 그리고 nifedipine과 약물 상호작용 가능성을 in vitro kinetic analysis를 이용하여 알아 보았다. DDB는 nifedipine을 Ki=0.45 uM로 강력한억제를 보여 주었으며 이러한 상수를 바탕으로 in vivo에서 nifedipine대사를 약 52% 정도 억제된다고 예측되어 체내에서
두약물을 병용 투여시 상호작용이 예측된다. 황금 추출물에서 분리한 5개의 flavomoid들은 CYP1A2에 억제 활성을 보여 주었고 특히 wogonin은 Ki값이 0.5 uMwjd도로 억제활성이 강력하였다. 이러한 활성은 flavonoid 구조중 hydroxyl group의 숫자와 위치가 억제활성과 isozyme 선택성에 영향을 준다고 추정되었다. Aucubin의 투여 경로에 따른 독성 가능성을 대사연구로 규명하고자 하였다. Aucubin을 경구로 투여시 혈중농도 지속시간과 간l신장에 covalent binding이 증가하였으며 이 는 b-glucosidase 에 의한 aglycontod성과 dialdehyde isomer의 단백질과 covalent binding에 기인되며 경구투여시 이러한 aglycon형성이 증가되어 기인된다고 추정되었다. 대사체 구조 규명을 위한 생체시료에서의 추출방법 개선은 homoxysteine, cysteine을 superfluid extraction방법을 이용하여 추출하는 방법을 개발하였으며 이 방법을 이용한 생체시료에서의 분석 감도와 재현성 이 우수하였다. 대사체 구조는 amiodarone과 cyclophenyl을 모델 화합물로 GC/MS 그리고 HPLC/MS/MS를 이용하여 in vitro, 그리고 뇨중으로 배설되는 phase I 대사체인 hydroxy 유도체와 phase II 대사체인 glucuronide 대사체의 구조를 분석하혀 metabolic pathway를 규명하였다. 시험관내 약물 투과나 대사 데이터를 이용하여 생체내 투과나 대사클리어런스 예측을 위한 기초 모델의 수정과 상관성 추론에 의한 기반기술을 확립함으로써 신약개발 단계에서의 비용을 줄이고 그 효율성을 높이고자 먼저 베타-차단약을 모델 약물로 하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 베타-차단약(atenolol, sotalol HCl, naldolol HCl, acebutolol HCl, pindolol, metoprolol tartrate, timolol maleate, labetalol HCl 및 propranolol HCl)의 시험관내 장관막 투과계수는 diffusion chamber법에 의해서 구하였으며, n-옥탄올/버퍼분배계수는 Cruickshank 등이 제시한 값을 그대로 인용하여 시험관내 장관막 투과계수와의 상관성 여부를 조사하는데 사용하였다. 또한 베타-차단약 중 atenolol, pindolol, metoprolol 그리고 propranolol을 웅성 흰쥐에게 각각 정맥투여, 경구투여 및 간문맥내투여를 실시하여 각 약물의 생체이용률 파라미터들을 구하였고 이들과 시험관내 데이터간의 상관성 여부를 조사해보았다. 유/수 분배계수와 장관막 투과계수 사이에는 양호한 상관성이 있음을 알 수가 있었으나, sotalol, naldolol, acebutol이 및 labetal이의 경우에는 상관성을 구할 수가 없었으며 p-glycoprotein에 의한 efflux와 같은 다른 기전이 존재할 것으로 사료되었다. 유/수 분배계수와 장관막 투과계수 값 그리고 4가지 베타-차단약을 경구 및 정맥 투여하여 얻은 약물동태학적 파라미터와의 상관성을 구하였을 때, 유/수 분배계수가 증가함에 따라 장관막 투과도가 선형성을 나타내고 있었다. 또한 경구투여시의 AUC/Dose, C_max/Dose 및 T_max, 정맥투여시의 AUC_∞, CL_t 및 V_ss와 유/수 분배계수 그리고 장관막 투과도와는 좋은 상관성을 나타냄을 알 수가 있었
다. 이로부터 베타-차단약을 이용한 약물 구조-약물속도론 파라미터 상관성 (QSPR, Quantitative Structure Property or Pharmacokinetic Relationship)을 유추할 수 있는 기초자료를 확보할 수 있음을 알 수 있었다. 본 과제에서 확립한 in vitro 모델에서의 약물대사, 대사체 구조, 그리고 in vivo 체내동태 예측 기법은 향 후 개발신약의 초기 스크리닝과 인체내에서의 거동예측에 매우 유용하게 응용될 수 있다고 사료된다.

Abstract ▼

Drug metabolism is being a more important issue in drug discovery because this study is essential to produce more safe and effective candidates. The purpose of the present project was 1) identification of the metabolic pathway, 2)elucidation of structure of metabolites, 3) inhibiton mechanism of enz

Drug metabolism is being a more important issue in drug discovery because this study is essential to produce more safe and effective candidates. The purpose of the present project was 1) identification of the metabolic pathway, 2)elucidation of structure of metabolites, 3) inhibiton mechanism of enzyme activity and prediction of drug-drug interactions, and 4) prediction of in vivo drug disposition. Incubation of DDB with human liver microsomes resulted in the formation of 5 metabolites and rate of metabolism of DDB was estimated to be 3.807 nmol/min/mgptrotein. The iden tification of P450 involved in the metabolism of DDB was done using various approaches. CYP1A2 is mainly involved in O-dealkylation reaction whereas CYP3A4 is responsible for demethylenation of methylenedioxy moiety. In order to examine the effect of DDB on P450 isozyme activities, inhibitory potency of DDB was estimated using iszyme-selective marker substrates. DDB selectively inhibited CYP3A4 activity with the Ki value of 0.314 uM. DDB inhibited CYP2C9 but the degree of inhibition was relatively low even at highest concentration.
DDB did not affect on CYP2D6, CYP2C19, and CYP2E1 activities. DDB caused a time- and concentration-dependent inactivation of testosterone 6b-hydrozylation. K_inact and Ki value were calculated to be 0.037 min^-1 and 8.69 uM, respectively. This inactivation is supposed to be mediated by metabolic intermediate. Methylenedioxy moiety was concerted to car ben intermediate and this intermediate tightly coordinate with Fe⁺⁺ in heme of P450 generating the absorption of 456 nm. MI-complex was formed ina dose dependent manner when DDB was incubated with human liver microsomes in the presence of NADPH. The decrese in the content of P450 was also observed in a does-dependent manner, further supporting the formation of MI-complex. When DDB was in administered to rats, metabolic saturation was observed and this phenomena is the formation of MI-complex. The possiblilty of drug-drug interactions of DDB with terfenadine, midazolame, and nifedipine was studies. DDB strongly inhibited nifedipine dehydrogenation with the Ki value of 0.45 uM. Based on kinetic parameters, The in vivo metabolism of nifedipine eas calculated to be inhibited by 52%. and interactions of these two drugs seems to be high when these drugs are administered simultaneously. The flavonoids isolated from Scutellariae radix showed the inhibition of CYP1A2 activity. Especially, wogonin strongly inhibited CYP1A2 activity with the Ki of 0.5 uM. These inhibitory activity was dependent on the number of hydroxylation and site of hydroxylation. The improvement of extraction efficiency for the estimation of metabolies was done using homocysteine and cysteine.
Superfluid extracion was proved to be powerful tools based on the linearity and sensitivity. The structural elucudatio was done using amiodarone and cyclophenyl as model compounds. Structures of 6 metabolites of amiodarone and 4 metabolites of cyclophenyl were elucidated by using GC/MS, LC/MS/MS. The glucuronide metabolites can be identified in HPLC/ES analysis. On the basis of recognizing that physicochemical properties, gastrointestinal permeability and pharmacokinetic characteristics of drug are the fundamental parameters controlling the rate and the extent of drug absorption, the biopharmaceutics drug classification system for correlation between drug solubility, gastrointestinal membrane permeability and in vivo bioavailability is proposed. The objective of this study was to assess whether the partition coefficient and in vitro gastrointestinal permeability of beta-blockers can be correlated with in vivo bioavailability. In vitro gastrointestinal membrane permeability (atenolol, sotalol HCI, naldolol HCI, acebutolol HCI, pindolol, metoprolol tartrate, timolol maleate, labetalol HCI and propranolol HCI) was determined by the diffusion chamber method using rat intestine. Gastrointestinal permeability (Papp) of each drug was calculated by Papp=V·dC/A·Co·dt. Four beta-blokers were administered intravenously and intraportally (2 mg/kg atenolol and metoprolol tartrate, 1 mg/kg pindolol and propranolol HCI), orally (4 mg/kg atenolol, 10 mg/kg metoprolol tartrate, 5 mg/kg pindolol and propranolol HCI) to rats. Serum samples were collected between 0-180 minutes (metoprolol tartrate, pindolol and propranolol HCI) and between 0-480 minutes (atenolol). The concentrations of four beta-blokers were determined with HPLC method using fluorescence detector. In vivo pharmacokinetic parameters such as bioavailability of four beta-blokers were evaluated by non-compartmental method using WinNonlin program.
There were good correlations between log P (n-octanol/buffer) and gastrointestinal membrane permeability (r=0.985, p<0.01), but no correlations in some cases such as sotalol, naldolol, acebutolol and labetalol. Maybe there are different transport mechanisms such as efflux by p-glycoprotein in some beta-blockers. And there were good correlations between some pharmacokinetic parameters and the partition coefficient, such as AUC/Dose, C_max/Dose and T_max obtained after oral administration of four beta-blockers (atenolol, pindolol, metoprolol tartrate and propranolol HCI), AUC_∞, CL_t and V_ss after intravenous administration. The log-transformed hepatic bioavailabilities of atenolol, pindolol, metoprolol tartrate and propranolol Hel in rats were also a good correlation with log P and log (permeability coefficient). The correlations obtained in this study indicated that in vitro diffusion chamber method could be used to predict in vivo bioavailability such as hepatic first-pass effect of four beta-blockers in rats. In conclusion, the method developed in this studies can be applied to new drug developement process.

목차 Contents

• 표 지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목 차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
• Summary ... 8
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 16
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 18
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 21
• 6. 첨부서류 ... 21
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 22
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 24
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 24
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 30
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 77
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 79
• 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 80
• 7. 참고문헌 ... 80
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 86
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 88
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 92
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 97
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 143
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 146
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 147
• 7. 참고문헌 ... 147
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 150
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 152
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 153
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 157
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 166
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 168
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 169
• 7. 참고문헌 ... 170
• IV. 부록 ... 172
• 끝페이지 ... 232