초록 ▼

냉장 · 냉동식품에 있어서 각종 부패 세균 및 병원성 세균에 의해 오염되어 있어 수송 · 저장중에 변식하여 국민보건에 큰 문제점이 되고 있다. 본 과제를 통해서 산업적으로 유용한 박테리오신을 첨가하여 항균포장필름을 제조하여 특성을 검토하고 최종적으로 냉장 · 냉동식품에 적용시킴으로써 주요 부패세균 및 병원성세균에 대한 식품의 안전성을 획기적으로 증대시킬 수 있었다.
제 1 세부과제명: 항균포장필름 제조를 위한 유용 박태리오신의 탐색, 대량생산 및 제제화기술 확립
마산 등지에서 시판중인 젓갈로부터 유용 박테리오신 생산균주를

냉장 · 냉동식품에 있어서 각종 부패 세균 및 병원성 세균에 의해 오염되어 있어 수송 · 저장중에 변식하여 국민보건에 큰 문제점이 되고 있다. 본 과제를 통해서 산업적으로 유용한 박테리오신을 첨가하여 항균포장필름을 제조하여 특성을 검토하고 최종적으로 냉장 · 냉동식품에 적용시킴으로써 주요 부패세균 및 병원성세균에 대한 식품의 안전성을 획기적으로 증대시킬 수 있었다.
제 1 세부과제명: 항균포장필름 제조를 위한 유용 박태리오신의 탐색, 대량생산 및 제제화기술 확립
마산 등지에서 시판중인 젓갈로부터 유용 박테리오신 생산균주를 분리하였다. 분리된 4종의 박테리오신 생산균주들을 각각 API50 CHL kit에 의해 탄소원 이용성을 검토한 결과, NK24, NK34, SA72균주는 높은 유의성으로 Lactococcus lactis subsp. ladis로 확인되었으며 SA131균주는 비교적 낮은 유의성으로 Lactobacillüs brevis로 동정되었다. 한편, 분리균주 4종에 의해 생산되는 항균물질들은 단백질가수분해효소에 대한 민감성으로 단백질임이 확인되었다. 4종류의 박테리오신에 대한 항균효과를 19종의 대상균주에 대해 검토한 결과, NK24, NK34, SA72박테리오신은 비교적 넓은 항균범위를 보였으나, SA131박테리오신은 3종의 균주에 대해서만 항균효과를 보였다.
젓갈에서 분리된 박테리오신 중에서 lacticin NK24를 유용 박테리오신으로 선정하여 특성을 검토하였다. Lacticin NK24 생산균주는 API test 및 전자현미경 관찰에 의해 Lactococcus lactis NK24로 잠정적으로 동정되었다. 발효조에서 생산을 검토한 결과, 배양된 지 2시간만에 처음 detection되었으며 early stationary phase인 7시간만에 최대 활성에 도달되었으며 그 이후에는 활성이 급속히 감소되었다. 발효조에서 생산된 배양상등액으로부터 75%황산암모늄침전법으로 96%의 회수율로 부분정제되었다. Lacticin NK24의 항균범위는 deferred method에 의해서는 대부분의 그람양성균, 그람음성균 중 E. coli 한 균주와 Pseudomonas aeruginosa, Sphingomosnas paucimobilis에 대해 항균효과가 있었다. 하지만 효모 및 곰팡이에 대해서는 항균활성을 확인할 수 없었다. Lacticin NK24는 protease XIV처리에 의해 완전히 불활성화됨으로써, 단백질임을 알 수 있었다. pH 2-9의 범위에서 매우 안정하였고, 90℃에서 30분간 열처리 하였을 때 항균활성을 그대로 유지하였으며, 각종 유기용매에 대해 매우 안정하였다. 대상균주에 대한 작용기작은 bactericidal한 양상을 보였다.
따라서 전통 발효식품인 젓갈에서 분리한 lacticin NK24는 비교적 항균범위가 넓고 식품에서 발생하가 쉬운 주요 부패 및 병원성 세균에 대해 뚜렷한 항균효과를 보이고 있으므로 향후 무독성 천연방부제 및 항균물질로서 활용이 가능하리라 판단되었다. 상업화되어 있는 nisin과 김치유래 박테리오신인 lacticin BH5와 본 연구에 의해 탐색된 lacticin NK24의 특성(단백질 특성, 항균범위, 활성 등)을 비교검토한 결과, lacticin NK24를 우수 박테리오신으로 선정하였으며, 상엽화되어 있는 nisin을 control로 사용하였다.
에탄올침전법을 통해 얻은 lacticin NK24를 ion-exchange column chromatography와 reversed-phase HPLC 또는 FPLC를 이용하여 순수정제를 실혐하였다. Lacticin NK24와 nisin의 유사성이 확인되었는 데, Nisin A structural gene(nisA) 에 특이적인 primer set으로 L. lactis NK24와 nisin A 표준생산 균주인 L. lactis ATCC 11454의 chromocomal DNA를 PCR반응의 template DNA로 하여 PCR을 수행하였다.
이를 2% agarose gel로 전기영동 분석한 결과 약 174 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있었으며, 이를 pGEM-T easy vector에 클로닝하여 DNA sequence를 결정한 결과 nisin A와 동일함을 알 수 있었다. 그러나 본 실험에 사용한 PCR primer는 sequence를 근거로 제작하였기 때문에 lacticin NK24가 nisin 분자 중 27번째 아미노산이 서로 다른 nisin A 인지 nisin Z인지는 3 primer 부분에 overlapping 되어 정확히 알 수 없었으므로, 이를 확인하기 위하여 새롭게 PCR primer를 제작하여 PCR 및 DNA sequncing을 진행하여야 할 것으로 생각되었다.
효율적인 부분정제법으로 결정된 40% 에탄올 침전법으로 박테리오신을 회수한 후 동결건조를 하여 항균필름제조를 위한 분말로 사용하였다.
박테리오신의 생산단가를 낮추기 위해서 여러 생산배지를 이용한 lacticin NK24의 생산을 검토하였다. 배지로는 MRS배지, M17배지 +0.5% lactose, BHI배지, MRS배지 +0.1M CaCl₂이 사용되었는데, MRS배지가 최적의 배지로 결정되었다. 한편, 여러 배양조건에 대한 박태리오신의 생산을 발효조규모에서 검토하였는데, pH는 6.0, 온도는 30℃, 접종비는 1%(v/v) 열 때, 가장 활성이 우수하였다. 생산방법의 최적화를 위해 유가식 배양을 실험하였다. 1, 2%(w/v) 포도당을 첨가하여 실험하였는데, 균의 증식은 많았으나, 박테리오신의 활성 증가는 확인할 수 없었다.
제2세부과계명: 박테리오신을 함유시킴에 의해 미생물 변패 억제의 기능을 가진 식품포장필름의 개발
i-propanol/n-propanol (2:1)에 녹인 polyamide 결착제에 세 종류의 박테리오신 (nisin, lacticin BH5, lacticin NK24)을 현탁시켜 저밀도 폴리에틸렌에 코팅시킴에 의하여 박테리오신 코팅 항균필름들을 제작하였고, 이 필름들은 Micrococcus flavus ATCC 10240균주에 대해 항균성을 보였다. 박테리오신의 이행은 3일에 이르러 평형에 도달하였으나 이행된 양은 아주 낮아 고체미생물 평판배지 상에서 여러 미생물 균주에 대하여 넓은 항균성의 범위를 보이지는 못하였다. 하지만 박테리오신 코팅 필름을 M. flavus ATCC 10240와 Listeria monocytogenes ATCC 15313를 함유한 인산완충액과 접촉시켰을 때, 이 두 미생물 균주의 생육을 현저히 억제하였다.
그리고 여러 조건에서 박테리오신 코팅 필름으로부터 박테리오신의 이행과 그 항균성의 상호관계를 살펴보았다. Nisin 코팅 필름과 식품모사 용액으로서 NaCl 용액을 접촉시키면, 유의하게 많은 nisin의 용출을 나타내었으나, 이것이 M. flavus ATCC 10240에 대해서 높은 항균활성을 보이지는 않았다. 하지만 1% 구연산 용액은 lacticin NK24 코팅 필름과 접촉시 높은 이행을 보이지는 않아도 미생물에 대해서 높은 항균성을 보였다. 이는 박테리오신 코팅 필름의 항균성은 박테리오신의 이행정도보다는 모사식품 용액에서의 첨가제나 성분에 의해 크게 결정됨을 시사한다. 코팅 결착제 층에 계면활성제, NaCl, 구연산을 첨가시켜서 코팅하는 것도 필름으로부터의 이행의 수준을 증가시키지 못하였고, 아울러 항균활성도 향상시키지 못하였다. 박테리오신의 증류수로의 이행은 온도가 높을수록 평형 용출량도 높지만, Fick의 법칙에 따른 확산과정의 해석에 의해 얻은 확산계수는 온도가 높을수록 약간 낮은 값을 보였다. 그리고 전체적으로 nisin과 lacticin NK24는 평형 이행량 및 확산계수에서 유의한 차이를 보이지는 않았다.
Nisin이나 lacticin NK24로 코팅시간 저밀도 폴리에틸렌을 사용하여 생굴과 다진 소고기를 포장하고 3℃ 및 10℃ 에서 저장하면서 미생물적 및 이화학적 품질을 살펴보았다. 두 종류의 박테리오신 코팅 필름은 저장된 생굴과 다진 소고기에서 미생물 성장을 효과적으로 억제하였고, 화학적 품질특성의 보존에도 기여하였다. 박테리오신 코팅 필름이 이들 식품의 저장유통기한을 연장시키는 효과는 10℃에서 더 우수하였다. 결론적으로 본 연구로부터 박테리오신 코팅 필름의 제조방법을 개발하였고, 이들 필름을 냉장식품에 적용하였을 때 품잘보존에 도움을 주며 저장유통기한을 연장시킬 수 있음을 보여주었다.

Abstract ▼

Foods can be easily spoiled due to the growth of spoilage and/or pathogenic organisms during storage. Recently, public concerns on the safety of chemical preservatives have increased with consumers preference toward foods that have no preservatives or contain only natural antimicrobial materials hav

Foods can be easily spoiled due to the growth of spoilage and/or pathogenic organisms during storage. Recently, public concerns on the safety of chemical preservatives have increased with consumers preference toward foods that have no preservatives or contain only natural antimicrobial materials have been applied for the preservation of foods. This study consists of two parts as follows: 1) Screening of bacteriocin from various foods, determination of antibacterial effect, purification, characterization and enhanced production, 2) Development of bacteriocin-coated film.
All bacteriocinogenic isolates were identified as lactic acid bacteria. Isolate NK24, NK34, and SA72 were tentatively identified as Lactococcus lactis, whereas isolate SA131 was recognized as Lactobacillus brevis, according to the API50 CHL kit database. All antimicrobial substances produced from four lactic acid bacteria isolates completely lost their antibacterial activity after being treated with some proteases, indicating to their proteinaceous nature. The bacteriocin produced from isolates NK24, NK34, and SA72 showed a broad spectrum of activity when compared to those produced from isolate SA131. All bacteriocins isolated during the course of this study showed a bactericidal mode of inhibition. Isolate NK24 were selected among them, beca:use of this strain have good characteristics. The activity of lacticin NK24, named tentatvely as the bacteriocin produced by L. lactis NK24, was detected during the mid-log growth phase, reached a maximum during the early stationary phase, and decreased after the late stationary phase. Lacticin NK24 showed a relatively broad spectmm of activity against non-pathogenic and pathogenic microorganisms as assessed using the spot-on-lawn method. Its antimicrobial activity on sensitive indicator cells was completely destroyed by protease IX or protease XIV. The inhibitory activities of lacticin NK24 were detected during treatments up to 100℃ for 30 min. Lacticin NK24 was very stable over pH range of 2.0-9.0 and to all organic solvents examined. It demonstrated a typical bactericidal mode of inhibition against Leuconostoc mesenteroides KCCM 11324. The apparent molecular mass of lacticin NK24 was estimated to be in the region of 3-3.5 kDa, which was determined by the direct detection of bactericidal activity after SDS-PAGE. The gene encoding this bacteriocin was amplified by PCR with nisin gene.
These results indicate that the bacteriocin is a nisin-like bacteriocin. The optimal conditions such as medium and culture conditions for bacteriocin production in jar fermenter were investigated. Lactobacilli MRS medium an10ng several media was selected for enhanced bacteriocin production. Optinllzed conditions of pH, incubation temperature, and inoculum ratio were 6.0, 30℃, and l%(v/v), respectively. Bacteriocin activity in pH 6-controlled production was higher when compared to that of pH-uncontrolled one.
Bacteriocin-coated polyethylene film was developed, evaluated in their antinllcrobial properties and bacteriocin migration, and then applied to the packaging of chilled foods. The bacteriocins of nisin and lacticins were coated onto low ·density polyethylene (LDPE) film by being incorporated in a binder medium. A suitable· binder medium of polyamide among three mediums was selected based on the stability upon contact with water. The coated LDPE showed antinllcrobial activity against the microbial strain, kIicrococcus flavus ATCC 10240, on the agar plate medium, which was stable at 30°C for 5 months. Addition of skim milk in the medium and increase of coating thickness did not enhance the antimicrobial activity, while application of higher concentration bacteriocin increased the activity. The migration from bacteriocins reached equilibrium in three days, but its level was too low to show wider spectrum against several bacterial strains. When the bacteriocin-coated films were exposed to phosphate buffer solution containing strains of M. flavus ATCC 10240 and Listeria monocytogenes ATCC 15313, microbial growth of both strains was significantly suppressed. Migration of nisin was more affected by sodium chloride, citric acid, and surfactant in the contact solution than that of lacticin NK24. Antimicrobial activity of the bacteriocin-coated film was not solely determined by the migration of the bacteriocin to the contact solution, and the intrinsic nature of the solution against the microorganism is an important factor in controlling the degree of microbial inhibition. Incorporation of sodium chloride, citric acid, and surfactant in the coating medium did not improve the bacteriocin migration and the films antimicrobial activity. Migration degree of bacteriocins to water was higher with higher temperature. Diffusion coefficient obtained from Fick's law was slightly lower with higher temperature. There was no si.gnificant difference between nisin and lacticin NK24 in the equilibrated migration level and diffusion coefficient When compared to plain low-density polyethylene, plastic films incorporated with 2% bacteriocins effectively inhibited microbial growth on packaged oysters and ground beef at 3℃ and 10℃, contributed to the preservation of chemical quality, and extended shelf-life significantly. The effects of the bacteriocin-coated films on shelf-life extension for these products were more pronounced at a high storage temperature of 10℃. There was no difference in food quality preservation between the two types of antimicrobial film. Conclusively bacteriocin-coated films showed a good potential for improving the storage and safety of fresh foods at chilled temperature.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 12
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 21
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 26
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 29
• 6. 첨부서류 ... 29
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 84
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 86
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 87
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 89
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 106
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 108
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 109
• 7. 참고문헌 ... 110
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 112
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 114
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 116
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 121
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 139
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 140
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 141
• 7. 참고문헌 ... 141
• 끝페이지 ... 143