보고서 정보
주관연구기관 |
충북대학교 Chungbuk National University |
연구책임자 |
하태선
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참여연구자 |
김헌식
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2001-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
과제관리전문기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400017712 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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키워드 |
당뇨병성 선증.단백뇨.후기당화합물.반응성 산소종.항산화제.Diabetic nephropathy.Advanced glycosylation endproducts.Proteinuria.Reactive oxygen species.Antioxidants.
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초록
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당뇨병에서 신증발병시 나타나는 단백뇨는 고혈당이나 이차적인 당화합 단백, 또는, 비가역적 산물인 후기 당화합물 (advanced glycosylation endproducts, AGE) 과 관련성이 있는데 특히 사구체 여과에 중요한 크기와 전하장벽기능을 지니는 heparan sulfate proteog lycan (HSPG) 에 대한 당과 AGE의 역할은 당뇨병에서의 단백뇨의 발생과 신손상의 진행에 매우 중요할 것으로 사료된다. 이에 본 연구자들은 AGE를 생성하고 당과 AGE에 의한 백서 사구체 상피세포의 HSPG의 변화를 HSP
당뇨병에서 신증발병시 나타나는 단백뇨는 고혈당이나 이차적인 당화합 단백, 또는, 비가역적 산물인 후기 당화합물 (advanced glycosylation endproducts, AGE) 과 관련성이 있는데 특히 사구체 여과에 중요한 크기와 전하장벽기능을 지니는 heparan sulfate proteog lycan (HSPG) 에 대한 당과 AGE의 역할은 당뇨병에서의 단백뇨의 발생과 신손상의 진행에 매우 중요할 것으로 사료된다. 이에 본 연구자들은 AGE를 생성하고 당과 AGE에 의한 백서 사구체 상피세포의 HSPG의 변화를 HSPG에 대한 단클론항체를 이용한 sandwich -ELISA 방법과 rat perlecan promoter에 대한 probe를 이용한 northem blotting 분석으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
Fraction V 의 bovine serum albumin (B SA) 을 glucose-6-phosphate와 반응시켜 만든 당화합물 (AGE-BSA) 을 5㎍/㎠의 농도로 배양용기에 coating하고 control로는 당이 없이 BSA만 같은 기간 보관한 것(BSA)을 이용하였다. 성장능의 비교를 위하여 24-well 배양용기에 coating을 안하거나 AGE-BSA 또는 BSA로 coating 한 배양용기에 well 당 25,000개의 백서 사구체 상피세포를 배양하고 배양 24시간과 48시간에 직접 세포수를 세어 각 배양시간에서 각조건간에 의의 있는 차이를 발견할 수 없었다. HSPG의 변화는 AGE-BSA 또는 BSA 표면위의 사구체 상피세포에 배양액의 당의 농도를 5와 30mM로 하여 첨가하고 osmotic control로서 당 5mM에 mannitol율 25 mM을 섞어서 이를 각각 A5, A30, A25, B5, B30, B25로 group을 지었다. Sandwich-ELISA 방법에 의한 HSPG의 변화는 B5를 standard로 하여 2 days에는 각군간에 차이가 없으나 1 week에는 A30 외에는 모두 증가하였다. 이를 1 week의 B5와 비교하여도 A30와 B30에서 각각 78%와 95%로 유의 있게 감소하며 특히 A30가 더 감소하였다. Northem 분석으로도 B5에 대하여 A30에서의 HSPG에 대한 mRNA의 표현이 2 days와 1 week에서 각각 20%와 61% 의 유의한 감소를 보였고 A5는 1 week에서만 30%의 감소를 보였다. 그러나 B30의 경우는 10%내의 감소를 보였으며 유의하지는 않았다.
AGE에 따른 상피세포의 형태적 변화를 Scanning EM으로 살펴보면 AGE의 영향하에서 intercellular junctions의 손상을 관찰할 수 있었고 세포표면에서는 microvilli( 미세융모)의 융합을 관찰할 수 있었으며 이는 생체 내 단백뇨질환에서 볼 수 있는 여과율의 증가를 어느 정도 설명할 수 있고 상피세포의 족돌기 융합과 유사한 소견이다. 또한, 상피세포의 여과율을 측정하여 일주일간 배양한 상태에서 B5의 결과에 비해 A30의 여과율이 의의 있게 (19%) 증가함을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 AGE의 여과율 증가역할에 당이 부가적인 (additive) 역할을 하는 것으로 추론할 수 있다.
반응성산소종계의 연구결과를 요약하면, superoxide anion는 AGE가 있는 상태에서 감소를 보이나 의미는 없었고 probucol을 투여하여 어느 정도 superoxide anion의 추가감소를 볼 수 있었으나 역시 통계적으로 유의하지는 않았다. 반면, hydrogen peroxide 의 생성량은 AGE가 있는 상태에서 대조군에 비하여 증가를 볼 수 있었고 이는 probucol을 투여하여 회복하였다. 또한, hydroxyl radical의 생성량 역시 hydrogen peroxide의 결과와 유사하게 AGE가 있는 상태에서 대조군에 비하여 증가함을 볼 수 있었고 probucol을 투여하여 회복하였다. 따라서 AGE에 의한 ROS 의 손상기전를 hydrogen peroxide 의 증가와 이에 따른 hydroxy 1 radical의 증가로 설명할 수 있을 것이다. 또한, superoxide dismutase(SOD) 효소활성은 대조군에 비하여 AGE가 있는 상태에서 활성도의 감소를 볼 수 있었고 이는 probucol을 투여하여 어느 정도 회복하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 따라서 AGE에 의한 ROS 의 손상기전을 SOD 방어기전의 억제로 설명할 수도 있으나 한편으로는 증가한 superoxide를 제거하기 위하여 SOD가 소모되어 superoxide와 SOD가 감소하였다고 설명할수도 있다. 이러한 가설로 hydrogen peroxide의 증가 기전을 설명할 수 있다. 반면,catalase, glutathione peroxidase와 glutathione peroxidase 의 활성도눈 대조군에 비하여 AGE 가 있는 상태에서 활성도의 감소를 볼 수 있었으나 통계학적으로 유의하지 않았고 probucol 을 투여하여도 유의한 결과률 얻을 수 없었다. 즉 AGE에 의한 ROS 의 손상과 probucol의 방어기전은 사구체 상피세포에서는 catalase와 관련이 없을 것으로 사료되며 AGE 상태약 높은 H202농도를 설명할 수 있을 것이다. 또한, 따라서 AG 에 의해 생성된 superoxide를 제거하기 위하여 SOD가 소모되어 superoxide와 SOD가 감소하였을 것으로 사료되며 이러한 가설에 따라 hydrogen peroxide와 hydroxyl radicals 이 증가하고 따라서 사구체 상피세포의 ROS 에 의한 손상 기전은 hydrogen peroxide와 hydroxyl radicals 등에 의해 발생할 것으로 사료되며 이러한 손상기전은 항산화제인 probucol의 투여로 억제됨을 알 수 있다.
결론적으로, 당과 AGE의 사구체 상피세포의 HSPG 에 대한 변화와 여과율의 증가는 노출기간이 길수록 부가적인 효과로 억제하는 양상을 보이나 AGE의 영향이 더 크며 따라서 당뇨병성 신증에서의 단백뇨의 발생억제에 있어서 단기적인 당조절보다는 장기적으로 AGE의 생성억제가 더 중요할 것으로 사료되며 이러한 변화에는 hydrogen peroxide와 hydroxyl radicals 등에 의해 발생할 것으로 사료되며 항산화제인 probuclo의 투여로 억제됨을 알 수 있었다.
Abstract
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HSPG, a component of size- and charge-selective barrier of glomerular basement membrane, is one of important matrix proteins which has been known to be reduced in the kidney of diabetic patients or animals. To examine the effects of glucose and AGE on the HSPG production by cultured GEC and on glome
HSPG, a component of size- and charge-selective barrier of glomerular basement membrane, is one of important matrix proteins which has been known to be reduced in the kidney of diabetic patients or animals. To examine the effects of glucose and AGE on the HSPG production by cultured GEC and on glomerular permeability, we cultured rat glomerular epithelial cells (GEpC) on semipermeable membrane under normal (5 mM) or high glucose (30 mM) and AGE- or BSA-adding conditions(called A5, A30, B5, and B30). And, we measured the change of HSPG production by sandwich-ELISA assay and the permeability of BSA across the artificial glomerular membrane using ELISA method at 2 days and one week incubation periods. There was no difference in proliferation between 2 different conditions of culture plate surface. We measured the relative amount of the extracted HSPG and observed significant decreases in high glucose condition at one week incubation, and particularly on the AGE-coated surface as compared to the results of BSA -coated condition, by 22% and 5%, respectively. The expression of mRNA for perlecan promoter was decreased in condition of high glucose and AGE-coated surface by 20% at 2 days and 61% at one week. Even in normal glucose condition, the expression of mRNA was reduced by 30% at one week if the plate was coated with AGE. On SEM exam, we could see disrupted intercellular junction and fused microvilli on cell surface which meant this might induced leakage of materials. Furthermore, the increased passage , of BSA was shown only in the A30 condition at one week incubation period (19% increased, compared to the results of B5 condition).
In the view of ROS system, the amount of superoxide anion slightly decreased on AGE condition without significance. However, hydrogen peroxide was detected highly on AGE-coated condition compared to control(BSA-coated) and which reduced by probucol, and, hydroxyl radical have also showed similar results. Therefore, glomerular injury causing proteinuria may be induced by hydrogen peroxide and subsequently by increased hydroxyl radical. The activity of superoxide dismutase(SOD) have been decreased slightly on AGE-coated condition and recovered probucol partially. However, there were no significant changes on the activity of catalase, glutathione peroxidase, and glutathione peroxidase. Therefore, we might assume that induced superoxide had been converted to hydrogen peroxide by consumtive SOD and subsequently produced hydroxyl radical may also induced glomerular epithelial injury and eventually proteinuria
In conclusion, both high glucose and AGE have reducing effects on the production of HSPG by GEpC and morphological changes in vitro and their effects seem to be additive, however, the role of AGE is greater than that of glucose. Furthermore, these results seemed to be correlated to the increase of permeability. This means that the effort to inhibit AGE formation is more important than short-term glucose control for the prevention of diabetic proteinuria. And, these events might be induced by hydrogen peroxide and subsequently produced hydroxyl radical which could be reversed by . antioxidants
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 목차 ... 2
- 제출문 ... 3
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
- Project Summery ... 6
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 9
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 13
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 15
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 17
- 6. 첨부서류 ... 18
- 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ... 38
- 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 39
- 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 40
- 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 43
- 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 48
- 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구 성과 및 목표달성도 ... 50
- 6. 제 1 세부연구개발과제의 활용계획 ... 51
- 7. 참고문헌 ... 52
- 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ... 54
- 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 55
- 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 56
- 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 59
- 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 63
- 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구 성과 및 목표달성도 ... 65
- 6. 제 2 세부연구개발과제의 활용계획 ... 66
- 7. 참고문헌 ... 67
- 끝페이지 ... 68
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