초록 ▼

면역억제 후보물질 CKD-722의 신약화를 위한 전임상 연구로서 급성 및 아급성 독성 연구생체대사 연구， 장기이식에서의 효능(in vivo) 및 in vitro 작용기전 연구를 수행하였다.
<생체대사 연구>
1) HPLC를 이용한 CKD-722 의 분석법을 개발하였다. C₁₈ 켠럼을 이용하였고 검출파장은 270nm였으며， 이 때 detection limit은 1 μg/ml 이 었고 (signal-to-noise ratio 5), 상관계수값 R²는 0.9955로써 좋은 직선성을 보여주

면역억제 후보물질 CKD-722의 신약화를 위한 전임상 연구로서 급성 및 아급성 독성 연구생체대사 연구， 장기이식에서의 효능(in vivo) 및 in vitro 작용기전 연구를 수행하였다.
<생체대사 연구>
1) HPLC를 이용한 CKD-722 의 분석법을 개발하였다. C₁₈ 켠럼을 이용하였고 검출파장은 270nm였으며， 이 때 detection limit은 1 μg/ml 이 었고 (signal-to-noise ratio 5), 상관계수값 R²는 0.9955로써 좋은 직선성을 보여주었다.
2) 약동대사 연구에서 대사체 확인은 못하였으나 혈중농도 양상은 CKD-722을 1 mg/kg 로 쥐에 정맥주사 하였을 때 AUC는 770.14 μg.min/ml 이었고 최대농도는 34.47 μg/ml을 보여 주었으며， parent compound는 뇨로 배출되지 않는 것으로 나타났다.

CKD-722 의 장기이식 후 면역억제제로서 효과를 규명하기 위해 실험쥐(Lewis， Wistar, Fischer) 를 이용하여 동종이식 후 이식장기 생존률 향상과 췌장 도세포 생존률 향상을 분석하여 CKD-722 의 in vivo 효능을 알아보았다.
1) 이소성 심장이식 모델 (Rat) 에서， 이식장기의 생존률을 보았을 때 CKD-722 (O.03mg/kg) 를 사용한 실험군에서는 무처리군과 비교하여 거부반응이 9.2일에서 114 일로 연장되는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이것은 일반적인 면역억제제로 쓰여지는 cyclosporin A (5mg/kg) 를 처리하였을 때의 생존율 183 일에는 마치지 못하였다
2) 이식장기의 거부반응에 따른 cytokine의 역할을 규명하기 위하여 cytokine mRNA 의 발현을 측정한 결과 모든 실험군에서 IL-1β ， TNF-α ， TNF-β ，IL-6， IFN- r 가 발현되었다. 대조군의 경우， 이들 cytokine들이 1 일 후부터 증가되어 지속적으로 유지되는 반면 CKD-722( 0.03mg/kg)의 경우 5일째 가장 많이 발현되었다가 이후 감소하였으며， cyclosporin A(5mg/kg) 의 경우 7일째 가장 많이 발현되었다가 이후 감소되었다. 이는 이식장기에서 약물이 이들 cytokine의 발현을 지연시킴으로써 나타나는 결과로 생각되었다.
3) 세포이식에서의 효능을 알아보기 위하여 당뇨병 유발 쥐에서 췌장 도세포 이식을 시행한 결과(Lewis to Fischer), 거부반응이 현저히 빠르게 나타나 수술 4 일 후에 혈당이 증가하였고， 이러한 거부반응은 무처리군에 비해 4 일에서 7일로 CKD-722( 0.5mg/kg) 를 처리하였을 때 3일간의 연장을 보이기는 하였으나 약제의 독성으로 보이는 부작용에 의해 실험쥐 중 40%가 사망하였다.
또한 cyclosporin A(5mg/kg) 사용군이 14 일에 거부반응이 온 것에 비해 낮은 생존율을 확인할수 있었으며 췌장 도세포 이식에서 CKD-722 의 면역억제 효과는 회의적이었다.

Jurkat CD8-ξchimeric transfectant를 이용하여 T세포 수용체에 의하여 매개되는 활성화 신호전달 또는 AICD (Activation Induced Cell Death) 신호 전달 경로에서 CKD-722의 면역억제 작용 기전을 연구하였다.
1) CKD-722는 T 세포 선택적언 단백질인 ZAP-70 및 T 세포에서의 adapter protein으로 인정된 LA T(Linker for Activation of T ceII)의 인산화를 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌으며 cyclosporin A 및 FK-506과 다른 기작으로 현저히 낮은 농도(100 배 효과)에서 저해 효과를 보이는 것으로 나타났다.
2) CKD-722는 PBL의 증식 및 T세포 활성화에 관여하는 Lck 및 Fyn protein의 인산화를 저해하여 LAT, ZAP-70, ERK, Vav, SLP-76등 세포 활성화에 관련된 단백질의 인산화를 저해하는 것으로 나타났다.
3) CKD-722에 의하여 유도되는 세포 유도사 신호 전달 현상의 전사 언자 관련성 분석을 위하여 Jurkat stable transfectant를 이용하여 CKD-722의 NF AT expression 저해능을 조사한 결과 cyclosporin A에 비하여 매우 낮은 농도에서 NFAT의 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 또한 resting T cell에 비하여 활성화된 T cell에 대해 훨씬 높은 apoptotic activity를 나타냄을 확인하였다.
결론적으로， 활성화된 T 세포에 대한 선택적 apoptosis 기작을 나타내는 CKD-722의 분자생물학적 면역억제 효과는 기존의 면역억제제가 가지는 신장 및 간독성 부작용을 해소할 수 있는 새로운 개념의 면역억제제로 기능 할 수 있으며 기존의 면역억제제와 조합하여 투여할 때 보다 낮은 농도에서 증가된 면역억제 활성을 기대 할 수 있을 것으로 전망된다.

Abstract ▼

Organ transplantation to replace diseased organs has become a standard treatment modality due to an incessant transplant immunologic study and development of effective immunosuppressant. To develop an immunosuppressor which can specifically inhibit T cell activation, culture broth from 7,000 isolate

Organ transplantation to replace diseased organs has become a standard treatment modality due to an incessant transplant immunologic study and development of effective immunosuppressant. To develop an immunosuppressor which can specifically inhibit T cell activation, culture broth from 7,000 isolates of actinomycetes strains were tested for their immunosuppressive activity. A potent candidate, CKD-722 was purified from the culture broth, and identified as tautomycetin.
In order to develop the new drug of candidate, preclinical study of CKD-722 was performed. Main results of the study is as follows .
• Toxicology
Single dose toxicity was investigated in rats following intraperitoneal administration of CKD-722. Lethal dose was 5 mg/kg in rats. Target organs of toxicity were liver, kidney and spleen.
Repeat dose toxicity following intravenous administration of CKD-722 was studied in rats(28 days study). At or below the maximum tolerated dose(MTD, being 0.024 and 0.032 mg/kg/day in male and female rats), the toxicity profile was characterized by degeneration in liver, atrophy of glomerulus in kidney, The main dose-limiting toxicity was the effect on kidney. In surviving animals, effects were reversible after termination of treatment.
• Pharmacokinetics and Metabolism
The developed assay method of CKD-722 was on-line HPLC/ESI-MS using a reversed phase C₁₈ column and the detector was Photodiode Array detector system(The detectionwavelength was 270nm). The detection limit of the CKD-722 was below lug/㎖ based on the signal-to-noise ratio of 5. Calibration curve was constructed for the CKD-722 and it indicated good linear response at the analytical range of 1 ug/㎖ to 50 ug/㎖(²=0.9955).
In the pharmacokinetic study, it was difficult to identify the metabolites of CKD-722 in vitro system using rat microsome. When the CKD-722 was administered to rat. intravenously (1 mg/kg), the AUC was 770.14 ,ug.min/ml and the maximum concentration 4.47 ug/㎖ in the blood. However, the parent compound of CKD-722 was nol found in the urine. Since CKD-722 has 3 polar alcohol groups and lipophilic nature in this structure, it was expected to excrete in urine as conjugated form.
• In vitro Molecular Mechanism
We made CD8- ξ chimera Jurkat transfectant which has cytoplasmic tail of CD3 ξ and ecto plus transmembrane domain of CD8 as a fusion molecule and its tyrosine residues mutated clones for analyzing the immunosuppressive effect of CKD-722 and its T cell activation-AICD related molecular mechanism during the research peliod.
Through these analyzing system we identified T cell specific immunosuppresseive effect of CKD-722 and its pharmacologic effect can be more potent than 100 fold when we compared CKD-722 with commercial immunosuppressive drugs such as cyclosporin A and FK-506.
This potency of CKD-722 can be explained by observations obtained through immunoprecipitation after the stimulation of Jurkat CD8-ξ chimeras and they showed inhibition of phosphorylation of LAT, Vav, SLP-76, ERK and PLC γ -1. Lck and Fyn kinases were not affected by CKD-722 in their phosphorylation upon activation. In PBL (Peripheral Blood Lymphocyte), proliferation and T cell activation mechanism were also effectively inhibited by CKD-722.
In addition to these, we produced NFAT-SEAP Jurkat transfectant which has NFAT binding sites in IL-2 promoter in the SEAP-containing plasmid in Jurkat. Inhibition of T cell specific IL-2 induction was measured through SEAP Assay and CKD-722 showed remarkable inhibition capability when compared to cyclosporin A. Activated T cells were specifically inhibited by CKD-722 and this specificity for killing activated T cell were proven by PI staining.
This T cell specific effects would be highly promising in terms of eliminating or diminishing the side effects of commercial immunosuppressive drugs and combination therapy of CKD-722 with cyclosporin A or FK -506 will be powerful tool for curing autoimmune diseases or organ transplantation problems .
• In vivo Immunosuppressive Activity
we attempted to study the immunosuppressive effect of CKD-722 in rat heart transplantation and rat islet transplantation model.
Following intravenous injection of CKD-722 (0.03 mg/kg) in rodent heart transplantation for 14 days, graft survival was prolonged to 114 days from 9.2 days of control (no treatment) while in cyclosporin A(5 mg/kg) treated rat, the graft survival was 183 days.
In order to elucidate the immunologic mechanism of CKD-722, we analyzed the chronolgic change of cytokine mRNA expression in the graft.
Compared with the early expression of cytokine such as IL-lβ(J, TNF-α, TNF-β, IL-6 and IFN- γ from day 1 after heart allograft in control group, they were expressed on post of day 5 in CKD-722 treated rat showing delayed fashion. This pattern was more or less similar to the cyclosporin A treated rat in which cytokine expression was detected on post of 7 days.
Based on organ transplantation study, we performed a rodent islet portal vein allograft. Compared with the graft survival of 4 days in control, it was 7 days in CKD-722 treated rat and 14 days in cyclosporin A treated rat. In high dose (0.5 mg/kg) graft survival was 7days but with the cost of high mortality(40%). In contrast to the precise immunosuppressive effect of CKD-722 in organ transplantation, graft survival following islet transplantation was not efficacious in animal experiment using mono therapy

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 13
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 51
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 58
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 61
• 6. 첨부서류 ... 61
• 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ... 84
• 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 85
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 87
• 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 96
• 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 118
• 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구 성과 및 목표달성도 ... 124
• 6. 제 1 세부연구개발과제의 활용계획 ... 125
• 7. 참고문헌 ... 126
• 끝페이지 ... 126