보고서 정보
주관연구기관 |
경성대학교 KyungSung University |
연구책임자 |
류병호
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참여연구자 |
박종옥
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
과제관리전문기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400018079 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
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키워드 |
수산자원.항산화제.해조류.Marine resources.Antioxidant.Seaweeds.Streptomyces sp. Low Density Lipoprotein (LDL).
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초록
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수산 자원인 해양은 지구면적익 2/3을 점유하고 있고 지구전체의 담수용적의 99%를 차지하고 있어 거대 생물에서 미생물에 이르기까지 다종다양한 생물이 살고 있다. 이러한 해양 생물은 육상 생불과 전혀 다른 환경에서 생육하므로 물질대사의 경로도 달라 새로운 구조를 갖는 유용물질을 생산할 수 있를 것으로 기대된다. 또 해양생물은 열대, 아열대, 해역에 서식하고 있는 해양 생물은 대단히 고말도로 생활하고 있고, 복잡한 생태계를 형성하여 공생 또는 방어에 관련하는 물질로서 유인 또는 기피물질 등 다양한 물질을 생성하고 있다. 이러한 각종
수산 자원인 해양은 지구면적익 2/3을 점유하고 있고 지구전체의 담수용적의 99%를 차지하고 있어 거대 생물에서 미생물에 이르기까지 다종다양한 생물이 살고 있다. 이러한 해양 생물은 육상 생불과 전혀 다른 환경에서 생육하므로 물질대사의 경로도 달라 새로운 구조를 갖는 유용물질을 생산할 수 있를 것으로 기대된다. 또 해양생물은 열대, 아열대, 해역에 서식하고 있는 해양 생물은 대단히 고말도로 생활하고 있고, 복잡한 생태계를 형성하여 공생 또는 방어에 관련하는 물질로서 유인 또는 기피물질 등 다양한 물질을 생성하고 있다. 이러한 각종 물질은 아주 흥미있는 생리 활성을 발현하는 것으로 알려져 새로운 생리활성 물질을 개발할 수 있다.
본 연구는 수산 자원을 이용하여 산기능성 식품소재 또는 성인병인 혈액 순환계 질환인 고혈압, 동맥경화등의 원인물질로 알려진 혈장중의 Low Density Lipoprotein(LDL)의 산화를 억제할 수 있는 항산화제를 탐색하고 그 작용을 규명하여 이를 출발물질로 하여 새로운 항산화제의 개발을 시도하였다.
1제 1 세부과제는 해조류로부터 항산화제를 탐색하여 이를 대량추출 맞 분리, 정제하여 산화 관련효소의 억제효과 및 Low Density Lipoptotein(LDL)의 산화억제를 macrophages, 내피세포, 평활근 세포 등을 이용하여 항산화 활성을 규명함과 동시에 실험동물을 이용하여 작용 메차니즘을 규명하였다.
본 연구는 사람의 Low Density Lipoprotein(LDL)의 산화에 대한 항산화 효과를 조사하기 위하여 각종 해조류로부터 유기용매로 추출하여 실험하였다. 각종 해조류중 항산화 활성이 우수한 큰잎모자반을 유기용매로 추출한 후 silica gel column chromatography로 분획한 결과 chloroform methanoH80 20) 분획물이 항산화 활성이 높았다. 이 획분을 농축하여 TLC에 점적한 후 chlorofonn methanoHlO 1, v/v) 로 전개하여 분리된 5개의 band 중에서 band 4가 항산화 활성이 α-tocopherol보다 높았다. 사람 LDL 에 대한 CUS04유도 산화 활성을 thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 의 방법으로 측정한 결과 band 4를 5μ M-CUS04 존재하에서 LDL에 대한 항산화 활성을 실험한 결과 항산화 효과가 우수하였다. 이를 사람 LDL에 대한 macrophage mediated oxidation, J774-mediated oxidation system의 실험에서도 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
Gel electrophoresis 에 의한 실험에서도 native LDL과 비슷한 이동상을 볼수 있었고 conjugation diene에 관한 실험에서 억제효과가 우수하였다. 그리고 동맥 내피세포와 평활근 세포에서 1 25I-LDL의 upt하‘e와 degradation에서도 효과가 우수하였다.
이를 돌연변이원성을 알아보기 위하여 Salmonella typhimurium 균주로 확인한 결과 돌연변이 원성을 찾아볼 수 없었으며 세포독성은 없었다.
제 2세부과제는 심해 및 해양 생물에 부착되어 있는 해양 미생물로부터 항산화제를 탐색한후 이의 형태학적, 생리학적 및 배양학적 특성을 연구하여 균주의 분리 동정하였다. 이들 균주를 대량 배양하여 항산화제를 분리, 정제하고 산화 관련효소와의 관계를 측정하고 이를 hative human plasma의 LDL의 금속 매 개 산화를 macrophages, J774, P338 cell line으로 항산화 작용을 규명하였다. 해양에서 분리한 균주 KS-97은 기균사. 포자를 형성하였고 액체배 Z 에서의 성장은 전형적 인 방선균의 mycelium을 보였다. 배양특성, 세포벽의 L-DAP와 아미노산 및 당분색 결과 KS-97은 Streptomyces 속임을 알 수 있었고 Streptomyces sp. 라고 명명하였다. Streptomyces sp. 의 최적 배양 조건은 배양 온도 300C, pH 6.5에서 72시간 배양하였을 때
가장 높은 생육도와 항산화 활성을 나타내었다. Streptomyces sp. 의 각종 기질 중 탄소원에서는 glucose, fructoce, saccharose 등이 항산화 물질 생산에 적합 하였고 유기 질소원으로서는 polypeptone 이 좋았으며 무기 질소원으로는 (NH4hHP04가 가장 좋았다.
Streptomyces sp. 의 배양액을 유기용매획분, silicagel column(100cm x lOcm) chromatù-graphy, preparative TLC 및 HPLC로 분리, 정 제하였다.
분리, 정제된 획분을 IR, GC/에;IS , NMR로 측정하여 확인한 결과 3.4 dihydroindole 임을 알 수 았었다. 분리, 정제된 획분을 농축하여, thiocyanate 법, DPPH 법, 등 항산화 활성을 측정한 결과 그 활성이 우수하였다. 이를 사람 LDL에대하여 Cu2+ -mediated oxidation, J774 mediated-oxidation, macrophage-modification에 대 하여 항산화 활성 을 TBARS로 측정 한결과산화 억제 효과가 우수함을 알 수 있었다.
결과적으로 본 연구는 LDL의 지질 과산화에 대한 항산화 효과가 우수하였고 동맥경화제로서 개발가능성이 있었다.
Abstract
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The sea is occupied 2/3 of the face of the eanh which predominated amounts of 99% of the total water volume. Therefore, there is a lot of various specific living animals and plants exist from microoganisms to huge living body. These animals and plants of sea were grown up a quite different environme
The sea is occupied 2/3 of the face of the eanh which predominated amounts of 99% of the total water volume. Therefore, there is a lot of various specific living animals and plants exist from microoganisms to huge living body. These animals and plants of sea were grown up a quite different environment When compared with the living body of land, however they can produce to the useful compounds of new structure. Neveπhless survey including marine biotechnology have markedly lagged behind those conducted on land, s。that some food and few medicine were discovered to limited research. Now a day, many reseacher reported to new biological active compounds from specific environment of marine resources. In the view point of useful compounds production from marine resources which exist in marine resources, we already collected a number of biological active substances by the screening from marine resources‘Among the collected microoganisms, many of them have the capability to produce the antioxidant for new functional materials and low density lipoprotein (LDL) oxidation under specific environment. For the subject, screening of antioxidant from marine alge sea or microogarnism origins. This study was undertaken to evaluate antioxidative activities of substances iso!ated from marine resources against human low density lipoprotein CLDL). Methanol-water extract (80:20, v/v) of Sargassum ringgoldianum had the highest antioxidant activity and the active substance was purified by silica gel column chromatography by eluting chlorform methanol mixture (80:20, v/v).
The active fraction was seperated to several spots on the TLC in chloroform methanol (1 0:1, v/v) mixture. Antioxidative activity of band of fraction 2 on TLC was highest than that of a -tocopherol against human LDL oxidation by the method of thiobarbituric acid reactive substance (TBARS).
The band of fraction 2 inhibited the copper mediated oxidation of human ‘LDL witn almost completely at 1 or 2 rng/me. The Antioxidative activity isolated and successively purified from Sargassum ringgoldianum by using HPLC with organic solvent. The chemical structure of the active substance isolated identified as phloroglucinol phlorotanin by using IR, GC>MS, NMR.
The active substance inhibited at the 5 μ M -CUS04 mediated or cells mediated oxidation system of human low density lipoprotein in a dose dependent manner with completely inhibition, and it compound completcly protected LDL oxidation at same concentration from oxidation as measure as conjugated diene formation, also preserving BHA or dl- a -tocopherol. The electrophoretlc mobility observed apparently mobile phase for LDL oxidized in the presence of 5 μ M Cu2+ which conpared to native LDL. On the other hand, these strain isolated was identified and classified through mophological, biological or physiological and cultural conditions. This study was carried out to investigate the antioxidative activity of the strain obtained from marine ongm. The strain, KS-97 producing antioxidative activity have been isolated from seaweeds. The strain KS-97 was
forming myce1ial and spore. Growth in the broth medium showed myelium of a typical Streptomyces. sp. According to the experimental results of morphotogical, physiolgical characters, cell wall diaminopimelic acid isomers and amino acid, whole cell sugar extract, the strain was identified as Streptomyces sp. As a result, the strain KS-97 was named temporary as Streptomyces. sp. KS-97.
Streptomyces. sp. KS-97 produced the antioxidatíve effect in the medium of marine medium, the optima1 conditions of cultivation showed at 30oC, pH 6.5 during 72 times in optimal medium conditions with glucose, fructose, saccharose as carbon sources and polypeptone as nitrogen sources. Antioxidant produced from these strain was fermented as a large fermentation and then purified. Therefore, the antioxidant is carried out experiment the in vitro by using of macrophages, J774 or p338 cells for inhibition of LDL modification. As a results, the substance produced in culture broth by Streptomyces sp. was obtained by elution of sillicagel column chromatography with organic solvent. By NMR, IR or GC/MASS, antíoxidant purified from organic solvent fraction was identified and named as 5-dihydroxyindole. Antioxidants inhibited the oxidation of LDL toward J774 and macrophage.
These results suggested that the importance of further resarch of antioxidative compounds in the investigation of antioxidant for lipid peroxidation and atherosclerosis.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 목차 ... 3
- 1. 연구개발사업최종보고셔요약문 ... 4
- Project Summry ... 6
- II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 20
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 22
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 24
- 6. 첨부서듀 ... 25
- 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ... 45
- 1. 제 1 세부 연구개발과제 연구 결과 ... 46
- 5. 제 1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 72
- 6. 제 1세부연구개발과제의 활용계획 ... 73
- 7. 참고문헌(제 1 세부과제) ... 73
- 제 2세부연구개발과제 연구결과 ... 76
- 2. 제 2세부 연구 개발 과제 연구 결과 ... 77
- 5. 제 2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 107
- 6. 제 2세부연구개발과제의 활용계획 ... 108
- 7. 참고문헌(제 2세부과제) ... 108
- 끝페이지 ... 110
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