보고서 정보
주관연구기관 |
한남대학교 Hannam University |
연구책임자 |
이인수
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400018110 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
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키워드 |
살모넬라.병독성.침투.내산능.Salmonella.Pathonenicity.Invasion.acid.tolerance.
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초록
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결과
1. 새로운 invasion- 관여 유전자의 탐색
새로운 invasion 관여 유전자를 탐색하기 위해 이미 알려진 SPI1의 상위 그리고 하위에 위치한 DANs를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. 클론된 하위에 위치한 DNA 단편(3kb)의 염기서열을 분석한 결과 특이하게 낮은 GC함량(45%)을 나타내었는데 이 낮은 GC함량이 SPI1염기서열에서 특징적으로 나타난다. 클론된 하위의 DNA에 ORF(inuX)가 존재하였다.
2. Salmonella enterica serovar Typhimurium UK1과
결과
1. 새로운 invasion- 관여 유전자의 탐색
새로운 invasion 관여 유전자를 탐색하기 위해 이미 알려진 SPI1의 상위 그리고 하위에 위치한 DANs를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. 클론된 하위에 위치한 DNA 단편(3kb)의 염기서열을 분석한 결과 특이하게 낮은 GC함량(45%)을 나타내었는데 이 낮은 GC함량이 SPI1염기서열에서 특징적으로 나타난다. 클론된 하위의 DNA에 ORF(inuX)가 존재하였다.
2. Salmonella enterica serovar Typhimurium UK1과 SL1344의 hilA 유전자의 발현 양상 차이
transcriptional activator인 hilA의 발현은 산소, 삼투압 그리 고 pH와 같은 다양한 환경 조건에 의해서 조절을 받는다. HilA-lac fusion된 UK1은 최적 발현 조건에서 거의 발현되지 않았다. 그러나 SL1344hilA는 동일 조건에서 높은 발현도를 나타내었다. hilAKUK1-lac fusion과 hilASL1344-lac fusion의 ß-galactosidase 발현 차이를 유도하는 원인을 알아보기 위하여 hilAKUK1-lac fusion은 SL1344 그리고 hilASL1344-lac fusion은 UK1에 도입한 후 같은 조건에서 ß-galactosidase 발현을 확인한 결과 hilAKUK1-lac fusion은 UK1유전적 배경에서와 마찬가지로 거의 발현을 하지 않았으나 hilASL1344-lac fusion의 경우는 SL1344내에서와 같은 정도의 ß-galactosidase 발현을 보여주었다. 결과적으로 hilAKUK1-lac fusion과 hilASL1344-lac fusion의 ß-galactosidase 발현 차이를 유도하는 원인은 lac operon과 융합시킨 hilA DNA sequence에 내재된 것으로 추정된다. 두 균주에서 growth state에 따른 hilA 발현의 변화를 hilA promoter-lac fusion을 사용하여 조사한 결과 SL1344의 hilA 는 초기 log phase부터 상당한 정도로 발현되어 stationary phase까지 그 상태가 유지되었으나 UK1의 경우는 log phase와 stationary phase 모두에서 거의 발현되지 않는 것으로 나타났다.
다른 한편 두 균주에서 growth state에 따른 hilA 발현의 변화를 Northern hybridization을 통해서도 확인해 보았다. 그런데 UK1의 경우 Northern hybridization 결과는 hilA promoter-lac fusion을 사용한 결과와는 약간 다르게 나타났다. 즉 mid-log phase에서는 놀랍게도 hilA 유전자의 활발한 전사를 확인할 수 있었으며 그 전사량도 SL1344 hilA와 유사하였다. 그리나 SL1344의 경우는 mid-log phase 이후에도 높은 hilA 전사량을 보였으나 UK1의 경우는 mid-log phase 이후 hilA 전사량이 계속 감소하였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 UK1의 경우 hilA의 최적 발현 조건은 SL1344와는 상이하며 발현 조절에 있어서도 서로 차이가 있을 것으로 추정된다.
3. SPI 2 발현 조절
Salmonella Pathgenicity Island 2는 Salmonella 세포가 숙주세포에 침투하는 병독성 발현에 필수적인 초기 과정에서 중요한 작용을 한다. 여기서 우리는 SPI2의 발현에 있어서 산소농도, 삼투압, pH, 탄소고갈, glycerol 첨가와 같은 다양한 환경 요소가 미치는 영향에 대해서 조사하였다. SPI 2 발현 변화를 조사하기 위해 SPI 2의 주요 구성 유전자들인 ssaJ와 ssaK의 regulatory region (promoter 포함)을 promoterIess lac operon과 transcriptional fusion시킨 reporter plasmid를 제조하였다. 이 실험을 통해 낮은 산소, 낮은 삼투압, 약알칼리 조건에서 ssaJ와 ssaK의 발현이 증가하였고, 이들 세 조건이 동시에 충족되었을 때 ssaJ와 ssaK 의 발현율이 가장 높게 나타났다. 그리나, 탄소고갈, glycerol 첨가는 두 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았다. 그리고 이러한 환경적 영향은 야생형 Salmonella typhimurium(LT2, UK1, SL1344)에서 모두 동일하였다. 아울러 hilA 돌연변이주를 이용한 실험에서 SPIl의 transcri ptional actiγator인 hilA는 ssaJ와 ssaK의 발현에 아무런 영향을 주지 않았다. 이러한 결과로 불 때 SPI1과 SPI2는 별개의 조절계에 의해서 그 발현이 조절된다는 것을 강하게 제안하고 있다.
4. Anaerobic Acid Tolerance Response는 Salmonella의 병독성 발현에 중요한 요소이다.
산성환경은 Salmonella typhimurium이 병독성을 나타낼 때 접하게 되는 중요한 환경 조건이다. Acid Tolerance Response(ATR)은 S. typhimurium이 치사 산성조건에서의 생존을 가능하게 해준다. 병원성 대수생장기의 ATR은 S. typhimurium이 외부의 낮은 pH(pH5.8 이하)에 의해 유도되는 적용성 산저항계이다. ATR은 두 과정으로 진행되는데 첫째, 호기적 ATR로서 호기적 조건에서 극한 산성조건에서 세포내 pH를 증가시키는 pH 항상성기전이며, 두 번째 과정은 혐기적 ATR은 무산소 환경에서의 내산성 반응이다. P22 MudJ(Km, lacZ) operon fusion 방법과 sodium acetateOOmM, pH4.5) 를 이용해 낮은 pH에서 사멸하는 돌연변이주 aatA:MudJ를 분리했다. 혐기적 조건에서 aatA는 야생형 UK1에 비해 산에 민감성을 나타냈다. aatA 의 유전작는 Salmonella Genetic Map상의 12분대에 위치해있다. 또한 aatA 돌연변이주는 female BALB /c mice의 splenic macrophage에서 민감성을 나타냈다. 이 결과는 S. typhimurium의 ATR은 macrophage 내에서의 중요한 생존전략이다.
Abstract
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Results
1. Screening of novel invasion-related genes
To find novel invasion-related genes, DNAs upstream and downstream of known SPI 1 were cloned and sequenced. Sequence analysis showed that GC content in cloned downstream DNA fragment(3 kb) was unusually low(45%). This low GC content is a ch
Results
1. Screening of novel invasion-related genes
To find novel invasion-related genes, DNAs upstream and downstream of known SPI 1 were cloned and sequenced. Sequence analysis showed that GC content in cloned downstream DNA fragment(3 kb) was unusually low(45%). This low GC content is a characteristic of SPI 1 sequence. An ORFUnvX) were found In cloned downstream DNA.
2. The difference of hilA expreSSIOn between Salmonella enterica serovar Typhimurium UK-1 and SL1344
Transcriptional activator, hilA expression is regulated In response to many environmental conditions, including oxygen, osmolarity and pH. HilA-lac fusion in UK1 was rarely expressed in optimal expression condition. But SL1344 hilA was highly expressed in the same conditions. To investigate a cause that induces this difference, hilAUK1-Iac fusion was transduced in SL1344 background and hilASL1344-lac fusion in UK1. β-galactosidase activity was examined under the same conditions and unexpectedly found that hilASL1344-lac fusion in UK1 background was highly expressed but hilAUK1-lac fusion in SL1344 background was rarely expressed. Consequently, a cause that induces the expression difference is implicated to be within hilA sequence fused to lac operon. Therefore growth dependent hilA expression was tested using hilA promoter lac fusion. It is shown that hilA of SL1344 was significantly expressed from early log phase through to stationary phase and that of UKI was, conversely, rarely expressed at both phases.
Secondly, Northern hybridization, in case of UK1, was different from that of hilA promoter-lac fusion experiment; Surprisingly, hilA was actively transcribed at mid-log phase and transcription level of UK1 was similar with that of SL1344. But hilA transcription level of SL1344 was still high after mid-log phase and that of UK1 was continuously reduced. Therefore these results show that optimal expression condition and regulation of UK1 hilA were different from those of SL1344.
3. Control of SPI 2 expression
Salmonella Pathgenicity Island 2 plays an important role in Salmonella pathogenicity, especially invasion into host cell. We have investigated the effect of various environmental factors, such as oxygen level, osmolarity, pH, carbon starvation and glycerol addition on the expression of SPI2. For this research, the reporter plasmids were constructed, in which the promoterless lac operons are fused with the regulatory regions(including promoter) of ssaJ and ssaK, major genes in SPI2. The study using the reporters showed that low oxygen, low osmolarity, or weak alkali conditions increased the expression levels of ssaJ and ssaK and when these three conditions exist simultaneously, the expression levels of ssaJ and ssaK are highest. However, carbon starvation and glycerol addition did not affect the expression of ssaJ and ssaK. And these environmental effects on the expression levels of ssaJ and ssaK are equal to three Salmonella typhimurium wild types(LT2, UK1, and SL1344). In addition, the mutation in hilA were confirmed, a regulatory gene encoding a transcriptional activator of SPI1 had no effect on the expression of ssaJ and ssaK. Thus, these results strongly suggest that the expressions of SPI2 and SPI1 are regulated by different control systems.
4. Anaerobic Acid Tolerance Response iS important system for virulence of Salmonella
Acid IS an important environmental condition encountered by Salmonella typhimurium during its pathogenesis. The acid tolerance response(ATR) enables S. typhimurium to survive in potentially lethal acidic environments. The ATR in log phase is an adaptive acid protection system induced at external low pH values below pH 5.8 in virulent S. typhimurium. The Acid Tolerance Response(ATR) is a two processes. The first. aerobic ATR, process evokes the synthesis of emergency pH homeostasis system that alkalinize the cytoplasm during periods of extreme acid stress in aerobic condition. The second, anaerobic ATR is engaged once the external pH falls in anaerobic condition. Using the P22 MudJ(Km, lacZ) operon fusion technique and a lethal selection procedure combining low pH and sodium acetate(10mM, pH4.5), several mutants including aatA::MudJ were isolated. aatA was significantly more acid sensitive than the wild type UK1 to anaerobic condition. aatA locus was determined at 12 min on Salmonella Genetic Map. Also, aatA mutant was showed sensitive in splenic macrophage of female BALB /c mice. Therefore ATR of S. typhimurium is an important survival response in the macrophage.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
- Project Summery ... 8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
- 1) 연구개발의 배경 및 필요성 ... 10
- 2) 연구개발 목적 ... 14
- 3) 연구개발 내용 및 범위 ... 14
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 16
- 2-1. 연구개발 내용 ... 16
- 2-2. 연구개발 방법 ... 18
- 2-3. 연구개발 결과 ... 24
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 62
- 참고문헌 ... 66
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 71
- (1) 학술지 게재 ... 71
- (2) 학회발표 ... 71
- (3) 학위논문 ... 72
- (4) 산업재산권 ... 72
- (5) 기타 연구성과 ... 72
- (6) 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 72
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 73
- (1) 연구종료 2년후 예상 연구성과 ... 73
- (2) 연구성과의 활용계획 ... 73
- 6. 첨부서류 ... 74
- 끝페이지 ... 74
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