보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 의과대학 Seoul National University |
연구책임자 |
김석현
|
참여연구자 |
김정훈
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2000-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400018112 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
|
키워드 |
착상 전 유전진단.염색체 이상.배아.할구 생검.Multicolor FISH.Preimplantation Genetic Diagnosis(PGD). Chromosome.Abnormality. Embryo. B1astomere Biopsy..
|
초록
▼
을 많은 유전질환이 배아의 착상 전 유전진단의 임상 적응증이 될 수 있으며, 특히 인간 생식세포의 염색체 이상은 수정 장애, 초기 배아의 발생 정지, 착상 직후의 배아 사멸 자연 유산, 사산, 선생아 사망 등과 같은 전반적인 생식현상에 악영향을 미칠 수 있다. 이러한 원인언자 중 염색체의 수적 이상, 즉 이수배수체 (aneuploidy) 는 가장 대표적인 세포유전학적 원인이다. 또한 특정 남성언자 불엄환자의 정자에서 염색체의 수적 이상이 정상 가엄 남성에 비하 여 현저히 높은 것으로 최근 보고되고 있으며, 이는 남성언자 불염증의 적
을 많은 유전질환이 배아의 착상 전 유전진단의 임상 적응증이 될 수 있으며, 특히 인간 생식세포의 염색체 이상은 수정 장애, 초기 배아의 발생 정지, 착상 직후의 배아 사멸 자연 유산, 사산, 선생아 사망 등과 같은 전반적인 생식현상에 악영향을 미칠 수 있다. 이러한 원인언자 중 염색체의 수적 이상, 즉 이수배수체 (aneuploidy) 는 가장 대표적인 세포유전학적 원인이다. 또한 특정 남성언자 불엄환자의 정자에서 염색체의 수적 이상이 정상 가엄 남성에 비하 여 현저히 높은 것으로 최근 보고되고 있으며, 이는 남성언자 불염증의 적응증으로 체외수정시술(IVF-ET) 등의 보조생식술 (ART) 을 시행할 경우 수정 후 발생한 배아에서도 염색체의 수적이상을 내재하고 있을 가능성이 크므로 높은 자연유산율과 선천성 기형아의 출산이 예상될 뿐만 아니라 자손에게 유전되어 정신박약, 불임증 둥과 같은 유전질환을 유발하기가 쉽다. 따라서 남성인자 불임환자에서 보조생식술 시행 후 배아의 착상 전 유전진단은 다른 어떤 유전질환 보다도 우선적으로 시행되어야만 한다. 한편 배아의 염색체 이상을 기존의 세포유전학적 진단 기술로 검색하는 것은 불가능하다.
배아의 착상 전 단계에서 염색체 이상 등 유전질환의 진단올 위한 진단 기술의 개발에 있어서 배아의 할구 생겸법은 기본적으로 시행되어야할 시술일 뿐만 아니라 입상적으로 배아의 할구 생검 후 배아의 안전성과 생검된 할구를 이용한 진단 기술의 적용 가능성올 확립하기 위한 실험 통물을 이용한 배아의 공배양 등과 같은 배양 기술의 개선, 배아의 동결보존 기술의 개발 등의 기초 연구는 언간 배아에게 적용시 가장 최선의 방법을 고안 창출하는데 있어서 필수적으로 요구되는 기술이라 할 수 있다.
제 1 세부과제 인간에서의 착상 전 유전진단 기술 개발올 위한 동물실험 모멜의 개발에 서는인간 배아를 대상으로 한 착상 전 유전진단을 임상적으로 적용하기 위한 전 단계로서 Mouse 통붐섭험을 개밤하여 91 가 배아의 착삿 척 유천꺼단옴 위하 기반 기술로서 확립하였다. 1차년도 연구 결과 Mouse Fl 잡종 (C57BVCBA)을 대상으로 체외수정 후 생성된 배아에서 발생단계별로 1 개의 할구를 생겸한 후 생검된 배아와 할구를 체외배양한 결과 할구 생검 후 퇴행되었거나 상실배 단계까지 도달하지 못한 배아의 비율은 2-세포기에서 25.0%로서 대조군에 비하여 높았으나, 4- 세포기에서는 7.7%, 8-세포기에서는 0%로서 각각 대조군과 유의한 차이가 없었다. 또한 배아의 발생율에 있어서도 발생이 진전된 8- 세포기 배아에서 할구 생검을 적용하였을때 가장 좋은 결과를 얻었다. 배아의 발생단계별로 생검된 할구에서 발생이 진전된 배아의 비율은 2- 세포기에 생검된 할구에서 70.0%, 4- 세포기 할구에서 82.1%, 8-세포기 할구에서 63.6% 이었다.2차년도 연구에서는 1 차년도에 최적화된 할구 생검법올 이용하여 실제 임상 적용에 있어서 할구 생겸 후 배아 발생에 이상이 없으면서 최대 생컴 가능한 할구 수를 규명하기 위하여 체외수정을 통하여 생성된 8- 세포기 생쥐 배아에서 1 개에서 최대 4개까지의 할구를 γ 생검하여 발생 정도를 조사 분석하였다. 8- 세포기 배아에서 생검된 활구 수가 증가하여 도 만족할만한 배아의 성존율과 발생율을 얻었으므로 본 연구에서 적용된 할구쟁검법은 임상적용을 위한 안전한 사놓 방법이라고 사료된다. 또한 본 세부과제에서는 배아의 할구 생검 후배아의 체외배양 체계 개선을 위한 방법으로서 Vero cell을 이용한 공배양 체계를 구축하였다.
최적화된 공배양 체계를 할구가 생검된 배아의 체외배양시 적용한 결과 배아의 발생율이 증진 됨을 확인할 수 있였으며, 특히 단순 체외배양시의 결과와 비교하여 배아의 세포 수가 현저히 증가됨이 관찰되었다. 따라서 공배양 체계를 활용하면 보다 많은 수의 할구를 생검하여도 배아발생이 보상될 수 있으므로 착상 전 유전검사의 효율성올 향상시킬 수 있는 적절한 체외배양커계가 확립되었다 3차년도 연구에서는 할구 생검을 실시한 인간 배아에서 동결보존 (cryopreservation) 기술을 개발하기 위하여 할구가 생겸된 배아의 동결 및 융해 기술의 확립,생겸된 할구 수에 따른 배아의 동결보존 후 발생율 조사, 할구가 생검된 배아의 동결보존 후 배아 발생에 있어서 공배양의 효율성 조사 등올 시행하였다. 동결보존 및 융해 후 각 군에서 포배기 이상으로의 배아 발생율은 대조군에 비하여 모두 유의하게 낮았으며, 공배양올 실시한 후에도 동일한 결과를 나타내었다. 그러나 배아의 세포 수는 대조군에 비하여 동결보존 및 융해 후 배아 발생시 공배양을 실시하지 않은 군에서는 온전한 투명대군올 제외한 모든 군에서 유의하게 낮았으나, 공배양을 실시한 군에서는 5/8군과 4/8군올 제외한 나머지 군에서 유의한 차이가 없었다. 생검된 할구의 체외 배양에 있어서 비공배양군과 공배양군의 상호 비교시 세포분열이 일어난 할구의 비율은 유의한 차이가 없었으나 분열된 할구의 세포 수는 공배양군에서 유의하게 높았다. 제 1 세부과제 연구 결과 착상 전 배아에서의 유전진단을 위한 할구 생검사공배양을 이용한 체외배양 체계의 확립과 개선이 진단 효율을 증진시키는데 있어서 유용한 방법이었다. 또한 할구가 생겸된 배아의 동결보존에 대한 유용성에 있어서 동결보존 및 융해 후 발생한 배아의 충실도는 공배양을 통하여 극복되었다.
제 2 세부과제 연간 배아에서 착상 전 유전진단을 위환 Multicolor FISH 기술의 재발에서는 Multicolor FISH 기볍을 최적화시키고. 최단시간에 친다이 가능하도록 개발 향상시킨 후 인간 배아에서 생검된 할구를 대상으로 역색체의 이수배수체를 배아의 착상 천 단계에서 ㅇ하고자 하였다. 1 차년도 연구에서는 FISH 시술시 최적화의 최종 목표는 빠른 시간내에 정확한 결과를 얻는 것이므로 중기 염색체 및 간기 세포핵올 대상으로 FISH 시술의 제반조건을 최적화시켰다. 성염색체 특이 DNA probe를 이용하여 FISH를 시행한 결과 직접법에서 간접법에 바하여 2.5시간 더 빠르게 결과를 얻올 수 있었으며, 두 방법 모두에서 위음성 결과는 관찰할 수 없었다. 다음 연구 단계로 직접법 FISH 시술시 표적 DNA와 DNA probe를 동시에 denaturation 시키는 기법을 개발한 결과 기존 방법에 비하여 1시깐 정도 더 빠르게 결과를 얻올 수 있었으며, FISH 결과에도 전혀 영향올 주지 않았다. 따라서 FISH 사술시 기존 방법과 비교하여 3.5시간의 소요시간올 줄일 수 있게 되어 배아의 착상 전 유전진단에 가장 적합한 FISH 사술 방법을 개발 확립하였다. 체외수정시술시 비정상적으로 수정된 배아를 대상으로 인간 배아에서의 할구 생검 기술을 우선적으로 습득하였으며, 본 연구실에서·개발된 FISH사술 방법을 이용한 결과 생검된 할구 중 70% 에서 성공적언 FISH 시술 결과블 얻올 수 있었다.2차년도 연구에서는 1 차년도에 적정화된 FISH 기술의 제반 조건올 진일보시켜 비정상 수정 및 발생 정지된 연간 배아의 할구에서 FISH 시술시 조건을 최적화하였다. 배아의 착상 전유전진단 기술의 임상적언 유용성을 확보하려면 생검된 할구 모두에서 유전학적 이상을 진단할 수 있어야 하며, 가능한한 많은 수의 염색체에 대한 이상 유무블 동시에 관찰할 수 있어야하므로 FISH 시술 전 할구의 준비 조건 등을 개선하였으며, 다수의 염색체에 대한 정보를 동시에 얻을 수 있는 Multicolor FISH 기술을 개발하였다. 체외수정시술 환자 23명에서 얻은 37개의 비정상 수정 배아로부터 생겸한 총 118개의 할구를 대상으로 6-color FISH 기술올 적용한 결과 1l47R(96.6%) 의 할구에서 형광 signal을 이용하여 다양한 형태의 염색체 이상을 분석할 수 있어 인간 배아의 생검된 할구에서 Multicolor FISH 기술을 적용하여 90% 이상의 할구에서 형광 signal을 관찰할 수 있었다. 따라서 실제 엄상 적용을 위한 최적화된 Multicolor FISH 기술이 개발 확립되었다. 3차년도 연구에서는 1 ,2차년도에 개발 확렵되어 최적화된Multicolor FISH 기볍을 이용하여 실제적인 임상 적용 단계로서 남성언자 불임환자에서 체외수정시술시 ICSI 시술 후 발생한 배아에서 생검된 할구를 대상으로 인간의 유전질환 중 가장대표적인 세포유전학적 원인언 염색체의 이수배수체를 배아의 착상 전 단계에서 진단하였다. 즉 남성언자 불엄환자에서 ICSI 시술을 이용한 체외수정시술, 회수 및 처리된 정자, 혹은 정자세포를 이용한 ICSI 시술 시행, ICSI 시술 후 배아의 정상적인 수정 여부 판정 및 배아의 추가 체외배양, 할구 생검 및 Multicolor FISH 기술의 적용, 착상 전 유전진단, 정상 배아의 이삭 후 임신 진단, 엄선이 진단된 환자에서 양수검사, 배양 전 양수세포에서 Multicolor FISH의 적용, 배양 후 양수세포의 핵형 분석 둥을 시행함으로써 염색체 이상이 있는 태아의 출생올 사전에 예방할 수 있는 효과를 엄상 적용하여 직접 확인하였다. 제 2 세부과제 연구 결과 염색체의 수적 이상 가능성이 높은 남성언자 불엄부부에서 ICSI 시술사 Multicolor FISH를 이용한 착상 전 유전진단 기술은 이러한 불임부부에서 정상 임신올 이루기 위한 유용한 임상적 진단기법이 될 수 있을 것으로 사료되며, 동시에 정상 배아만을 자궁강내로 이식함으로써 임신 성공율도 증대사킬 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구 결과 총괄연구개발과제의 궁극적인 연구 목표가 만족스럽게 달성되어 언간의 유전철환 중 가장 대표적언 세포유전학적 원인언 이수배수체 둥의 염색체 이상올 배아의 착상 전단계에서 유저진단한 후 유전질환에 이환된 배아는 자궁내 이식올 시행하지 않음으로써 유전질환올 지닌 선생아의 출생으로 언하여 유발될 수 있는 개인적언 불행올 사전에 예방하고, 이에 부수적인 심리적, 사회적, 경제적 부담을 감소시킬 수 있을 것으로 사료된다.
Abstract
▼
The genetic defects in human gametes and embryos can cause the adverse effects on overall reproductive events. Biopsy of embryos for preimplantation genetic diagnosis(PGD) offers a new possibility of having children free of the genetic disease. In addition, advanced embryo culture method may enhance
The genetic defects in human gametes and embryos can cause the adverse effects on overall reproductive events. Biopsy of embryos for preimplantation genetic diagnosis(PGD) offers a new possibility of having children free of the genetic disease. In addition, advanced embryo culture method may enhance the effectiveness of embryo biopsy for the practical application of PGD.
Study I was undertaken to evaluate the effects of coculture on the development in vitro of biopsied mouse embryos and the effects of cryopreservation with or without coculture on the development in vitro of blastomere-biopsied 8-cell mouse embryos. This experimental study was originally designed for the setup of a preclinical mouse model for PGD of human embryos.
Embryos were obtained after in vitro fertilization(IVF) from F1 hybrid mice(C57BL Sf-/CBA ㅁ). Using micromanipulation, one to four blastomeres of 8-cell stage embryos were aspirated through a hole made in the zona pellucida by zona drilling(W) with acidic Tyrode's solution(ATS). After biopsy of blastomeres, embryos were cultured in vitro for 110 hours in Ham's F-10 supplemented with 0.4% BSA or cocultured for 110 hours on themonolayer of Vero cells in the same medium. A slow-freezing and rapid-thawing protocol with l.5M dimethyl sulfoxide(DMSO) and O.1M sucrose as cryoprotectant was used for the cryopreservation of blastomere-biopsied 8-cell mouse embryos. After thawing, embryos were also cultured or cocultured as the above. The blastocyst formation was recorded, andthe embryos developed beyond blastocyst stage were stained with 10% Giemsa to count the total number of nuclei in each embryo. There was no significant difference in the blastocyst formation between' control wna intact(ZI) group and ZD, or biopsied groups. The hatching rate of all the treatment groups except 4/8 group was significantly higher, compared with control group. In all the treatment groups, there was a significant reduction in the mean cell number of embryos beyond blastocyst stage(SO.2± 14.0 in control group vs. 41.2±7.9 in ZD, 39.3±8.8 in 7/8, 29.7±6.4 in 6/8, 2S.1 ± S.7 in 5/8, and 22.1 ± 4.3 in 4/8 groups, p<0.05). When the same treatments were followed by coculture with Vero cells, a similar pattern was seen ill the blastocyst formation and the hatching rate. However, ill all the treatment groups, there was a significant increase in the mean cell number of embryos beyond blastocyst stage with coculture, compared with the parallel groups without coculture. In the cleavage rate of biopsied blastomeres, there was no significant difference between coculture and noncoculture groups(87.2% vs. 78.7%). However, the mean cell number of embryos developed from the biopsied blastomeres was significantly higher in coculture group(11.5±4.7 vs. 5.9± 1.9, p<0.05). The survival rate of embryos after cryopreservation was significantly lower in the biopsied groups than in the non-biopsied ZI group. Without coculture, the blastocyst formation rate of embryos after cryopreservation was not significantly different among ZI,ZD, and the biopsied groups, but it was significantly lower than in the non-cryopreserved control group. The mean number of cells in embryos beyond blastocyst stage was significantly higher in control group(SO.2±14.0) than in 6/8 (26.5±6.2), 518(25.0±5.5), and 4I8(17.8±7.8) groups. With the coculture using Vera cells, the blastocyst formation rate of e~bryos after cryopreservation was significantly lower in 5/8 and 418 groups, compared With control, 7/8, and 6/8 groups. The mean number of cells in embryos beyond blastocyst stage was also significantly lower in 4/8 ,group(25.9±1O.2), compared with controHSO.2±14.0), 7/8(56.0±22.2), and 6/8(5S.3±25.5) groups.
In conclusion, the blastomere biopsy of mouse embryos after ZD with A TS is a safe and highly efficient method for PGD, and coculture with Vero cells showed a positive effect on the development in vitro of biopsied mouse embryos and blastomeres. Mter cryopreservation, the biopsied mouse embryos have a significantly impaired developmental competence in vitro, but this detrimental effect might be prevented by the coculture with Vero cells.
Biopsy of mouse embryos is a safe and) ,highly efficient preclinical model for PGD of human embryos, In Study II on the development of Multicolor FISH for PGD in human embryos, we attempted to attain the optimized methodology of Multicolor FISH technique, and then to apply the developed technique for the diagnosis of chromosomal abnormality such as aneuploidy in biopsied blastomeres of human embryos in a shorter time. As the final goal of the first-year study was to get an accurate and rapid result of FISH, the experimental conditions for FISH applied to the chromosomes of metaphase and interphase nuclei were optimized. Using sex chromosome-specific DNA probes, the direct method of FISH could show the results 2.5 hours earlier than the indirect method, and there were no false negative results in either method. The next step was to develop the simultaneous denaturation technique of both target DNA and DNA probe, and the duration time to get the results could be shortened by an hour without affecting the results of FISH, compared with the conventional method. Accordingly, the most appropriate methodology of FISH was developed and established through reducing the required time for FISH by 3.5 hours, compared with the conventional method. Human blastomere biopsy technique was also acquired utilizing the abnormally fertilized embryos in IVF-ET program, and the application of newly developed FISH technique resulted in 70% of success rate in our laboratory .
In the second-year study, the experimental conditions for FISH established appropriately in the first year were advancingly improved, and optimized utilizing the abnormally fertilized and developmentally arrested human embryos. To establish the clinical efficacy of PGD in human embryos, the ability to diagnose genetic abnormality in all the biopsied blastomeres is required, and many chromosomal abnormalities should be detected at the same time if possible. The conditions' for blastomere preparation prior to FISH were improved, and Multicolor FISH technique was developed for the simultaneous availability of information on many chromosomes. Multicolor FISH was applied to the" blastomeres biopsied from the abnormally fertilized and developmentally arrested human embryos, and the fluorescent signals could be observed successfully in more than 90% of blastomeres. With the application of 6 color FISH to 118 blastomeres biopsied from 37 abnormally fertilized embryos in 23 infertile patients undergoing IVF-ET, various chromosomal abnormalities were analyzed in 114 blastomeres(96.6%). Therefore, the most appropriately optimized Multicolor FISH technique was developed and established for the practical use of clinical application.
The third-year study included the clinical application of the optimized Multicolor FISH technique. Clinical PGD of chromosomal aneuploidy, one of the most frequent cytogenetic abnormalities, was performed in the biopsied blastomeres of human embryos obtained from IVF with IeSI using the testicular sperm in the male factor infertility couples. Normal pregnancy was achieved after intrauterine transfer of the chromosomally normal embryos
excluding the embryos with aneuploidy diagnosed successfully by PGD, and confirmed by karyotyping of the cultured amniocytes after amniocentesis. As a result, the clinical efficacy of Multicolor FISH directly applied to the chromosome analysis of numerous embryos obtained from IVF was confirmed.
In conclusion, PGD with Multicolor FISH can be an efficacious diagnostic technique in achieving normal pregnancy, especially when it is applied to the male factor infertility couples who are at high risk of having aneuploid offsprings. In addition, PGD makes it possible to achieve a higher pregnancy rate with the selection and transfer of normal embryos, compared with the conventional IVF.
In conclusion, the final goal of this project on the development of PGD using Multicolor FISH technique for the chromosomal abnormality in human embryos was" successfully achieved by establishment of the prevention measures on the birth of infants with aneuploidy which is one of the most frequent chromosomal anomalies. This was made possible by PGD of biopsied blastomeres and by not transferring the embryos diagnosed as having aneuploid chromosomes. In virtue of the state-of-the-art PGD with Multicolor FISH, giving birth to a normal healthy baby in the high risk, infertile couples can prevent the misfortune of individual life, and reduce the medical and social cost of cang the handicapped children.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
- Project Summery ... 7
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 26
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 33
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 38
- 6. 첨부서류 ... 41
- 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ... 42
- 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 43
- 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구 대상 및 방법 ... 44
- 3. 제 1 세부연구개발과계의 최종 연구개발 결과 ... 50
- 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 59
- 5. 제 1 세부연구개발과체의 연구성과 및 목표달성도 ... 64
- 6. 제 1 세부연구개발과제의 활용계획 ... 65
- 7. 참고문헌 ... 67
- 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ... 72
- 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 73
- 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구 대상 및 방법 ... 75
- 3. 제 2 세부연구개발과계의 최종 연구개발 결과 ... 84
- 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 95
- 5. 제 2 세부연구개발과체의 연구성과 및 목표달성도 ... 98
- 6. 제 2 세부연구개발과제의 활용계획 ... 99
- 7. 참고문헌 ... 102
- 끝페이지 ... 106
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.