초록 ▼

IV. 연구 개발 결과
1. 칼습 이온 통로 β3 유전자 결손 생쥐의 생산 및 유전자 결손 확인
유전자 적중법으로 만들어진 칼숨 이온 통로 ß3 (+/-) 유전자 변이 생쥐끼리의 교배를 통해서 나온 새끼들의 칼숨 이온 통로 β3 +/+, +/-, -/- 각 유전자형이 1:2:1 로 나왔으며， 이 중 homozygote 의 뇌 조직으로 부터 추출해낸 RNA와 단백질에서의 칼숨 이온 통로 β3 유전자 산물의 결손 여부를 Northem, Westem 분석을 통하여 분석한 결과， 예상한 대로 ß3 단백질이 전혀 만들어지지 않는

IV. 연구 개발 결과
1. 칼습 이온 통로 β3 유전자 결손 생쥐의 생산 및 유전자 결손 확인
유전자 적중법으로 만들어진 칼숨 이온 통로 ß3 (+/-) 유전자 변이 생쥐끼리의 교배를 통해서 나온 새끼들의 칼숨 이온 통로 β3 +/+, +/-, -/- 각 유전자형이 1:2:1 로 나왔으며， 이 중 homozygote 의 뇌 조직으로 부터 추출해낸 RNA와 단백질에서의 칼숨 이온 통로 β3 유전자 산물의 결손 여부를 Northem, Westem 분석을 통하여 분석한 결과， 예상한 대로 ß3 단백질이 전혀 만들어지지 않는 null mutation 임을 확인하였다. 이를 통하여 더 3 (-/ -) homozygote 생쥐가 정상적으로 성장 발달할 수 있으며， 따라서 베타3 유전자가 생쥐의 발달 과정에 필수적인 것은 아님을 확인하였다.
2. 칼숨 이온 통로 β3 유전자 결손 생쥐의 형태학적， 병리해부학적 연구
칼슐 이온 통로 베타3 유전자 결손 생쥐에서의 해부병리학적 변화를 관찰하기 위하여 생후 약 7 개월된 유전자 결손 생쥐와 같은 배에서 태어난 정상쥐를 대조군으로 하여 두 군을 비교 겸사하면서 조직학적으로 관찰한 결과 유전자 결손 생쥐에서 그 어떤 이상도 관찰되지 않았다.
3. β3 유전자 결손 생쥐의 교감 신경 세포인 SCG에서의 전기 생리학적 연구
Superior cervival ganglion (SCG) 뉴론의 칼숨 통로를 통한 Ba2 > current 를 whole-cell patch cIamp 방법을 이용하여 겠다. I-V curve 를 비교해 봤을 때는 mutant와 wild type 두 그룹사이에 통계적으로 별 차이를 보이고 있지 않았으나， 여러 drug들을 이용해서 각 type의 채널을 통한← current를 겠을때 mutant에서 w-CTx-GVIA 에 의해서 사라지는 N-type 의 current density 와% current 7} wild type 에 비해서 50% 정도 감소되어있는 것으로 나타났다. mutant 와 wild type을 비교하기위해서 N-type 이 차지하는 비율과 거기에 해당하는 뉴론의 숫자를 cumulative하게 plot 하여 mutant 에서 N-type의 비율이 적은 뉴론이 증가되어 있는 것을 알 수 있었다. 반면 P/Q type 이 나 L-type 등은 변화가 없었다.
4. 더 3 유전자 결손 생쥐를 이용한 우울증의 형성 및 항우울제들의 작용기작에 대한 연구
첫번째 trial 에서 15분간 수영시키고 이로부터 24시간 후에 6분간 강제수영시켰으며 이때 처음 2분을 제외한 나머지 4분동안의 부동시간을 겠다. 각 그룹의 평균 부동시간은 wild type 159.56 土50.40, mutant 112.75 ::t 53.49 (mean ::t SD) 였으며 이를 Mann-Whitney test를 해보면， 이 통계상으로는 정상의 생쥐와 차이가 없게 나왔다. (p-value= 0.112) 그러나 p-value 가 0.112 로 좀 더 마릿수를 늘려 실험해 볼 경우 통계적으로 의미있는 차이가 날 가능성이 있다고 판단된다. 따라서 현 상태의 data 만을 가지고 두 그룹사이에 차이가 없다고 결론을 내리는 것은 위험하다고 생각한다.
5. 칼슐이온 통로 alD 유전자 결손 생쥐
칼숨이온 통로 alD 유전자 결손 생쥐의 생산을 위하여 적중 벡터를 제조 하였으며 특별히 alD 유전자의 발현 패턴을 쉽고 특아적으로 보기 위해서 ， alD 유전자의 endogenous promotor에 의해 reporter 유전자가 발현되도록 첫번째 coding exon 중간에 EMCV 바이러스의 5’ NTR 부분과 β-galactosidase 유전자를 넣었다. 이 적중 벡터를 이용하여 배아간세포에 electroporation하여서 총 700여개의 G418/Gancyclovir resistant 클론을 얻었으며， 그 중에서 southem blot을 통하여 하나의 적중 클론을 얻었다. 현재 이 클론을 이용하여 5마리의 80% 이상 카이머리즘의 카이메라를 얻었다.

Abstract ▼

Voltage-dependent calcium channel (VDCC) plays a major role in the regulation of calcium entry in many cell types. To investigate the function of calcium channel β 3 subunit which is expressed predominantly in brain and thought to be mostly associated with N-type al subunit, we have tried to make an

Voltage-dependent calcium channel (VDCC) plays a major role in the regulation of calcium entry in many cell types. To investigate the function of calcium channel β 3 subunit which is expressed predominantly in brain and thought to be mostly associated with N-type al subunit, we have tried to make and analyze β 3 knock-out mice generated via gene targeting. Nowadays gene targeting became a most popular and powerful technique for analyzing in vivo gene function on various levels, i.e. molecular, cellular, and organismal levels ..
Animals homozygous for this mutation developed and reproduced without obvious phenotypes.. Northern blotting, Western blotting, and immunohistochemical analysis confirmed the absence of the β 3 gene product. Histological analysis of the various
organs of the β3 knock-out mice showed no apparent abnormalities. Then we measured Ba²⁺ currents through calcium channels in culrured Superior Cervical Ganglion (SCG) neurons by whole-cell patch clamp. The averages of the N-current density are 13±2.5 pAjpF (wild-type, mean:tSEM, n=17) and 6±1.5 pAjpF (mutant, n=16, pNext, to make a knock-out mice for one of the L-type channel gene, a lD, we made a targeting vector. Especially, to see expression pattem of this gene with a high specificity, we add the ß -galatosidase gene as a reporter with 5’NTR of EMCV into the first coding exon of a lD gene. One embryonic stem cell clone with a targeted α lD allele were obtained out of 700 G418/Gancyclovir resistant clones. Now five chimeric mice have been obtained by microinjection of the targeted ES cells into C57BL/6J blastocysts.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구개발 최종보고서 ... 3
• 제출문 ... 4
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 9
• Contents ... 10
• 목차 ... 11
• 제 1 장 서 론 ... 12
• 제 1 절 연구개발의 목적 ... 12
• 제 2 절 연구개발의 필요성과 중요성 ... 12
• 제 2 장 국내.외 기술개발 현황 ... 14
• 제 1 절 국외의 기술개발 현황 ... 14
• 제 2 절 국내의 기술개발 현황 ... 15
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 17
• 제 1 절 칼슘이온 통로 β3 유전자 결손 생쥐의 분석 ... 17
• 제 2 절 칼슘이온 통로 αlD 유전자 결손 생쥐의 생산 ... 20
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 26
• 제 1 절 연구 개 발 목표 달성도 ... 26
• 제 2 절 연구 개발 결과의 대외 기여도 ... 26
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 28
• 제 1 절 다른 유전자 변이 생쥐와의 double mutant 생산 및 분석 ... 28
• 제 2 절 칼슘 이온 통로 αlD 유전자 결손 생쥐 생산 및 분석 ... 28
• 제 6 장 참고문헌 ... 29
• 최종보고서 요약(초록) ... 32
• 끝페이지 ... 32