[보고서]뇌졸중 및 척수손상 동물모델에서 임상적용가능 줄기세포의 이식치료법 개발을 위한 전임상 연구

보고서 정보

주관연구기관

차의과학대학교 산학협력단
CHA University

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2014-04

과제시작연도

2011

주관부처

보건복지부
[Ministry of Health & Welfare(MW)(MW)

등록번호

TRKO201400022439

과제고유번호

1465010092

사업명

보건의료기술연구개발

DB 구축일자

2014-11-22

키워드

뇌졸중.척수신경손상.성체줄기세포.유도만능줄기세포.바이오마커.Stroke.Spinal cord injury.Adult stem cells.Induced pluripotent stem cells.Biomarker.

DOI

https://doi.org/10.23000/TRKO201400022439

표 인간 뇌졸중을 대상으로 한 임상시험 현황. 2005년 대한민국에서 골수유래 중간엽줄기세포
표 전임상/임상단계에서 최적의 줄기세포 치료방법을 구축하기 위한 줄기세포 배양 및 제공 (제3세부), 뇌졸중 동 물모델에서 줄기세포 효능 조사 (제1세부) 및 척수신경 동물모델에서 줄기세포 효능 조사 (제2세부).
표 뇌졸중 동물모델 행동분석 및 투여방법 구축 (A) Staircase test, (B) Rotarod test, (C)Apomorphin test, (D) 90 min MCAo model 제작, (E) Stereotaxic surgery를 통한 줄기세포 뇌내 이식, (F) 경동맥 주입 시술
표 NYU 충격기를 이용한 실험 모습. 무게추 낙하 방식의 실험은 재연성이 우수하고, 기존 연구가 많아 척 수손상 연구의 기본이 되고 있음.
표 Establish되어진 3종의 인간유도만능줄기세포
표 (A) 제작된 3종의 유도만능 줄기세포로부터 qRT- PCR을 통한 Oct- 4, Sox2의 endogene 발현 확인. (B) EB differentiation method를 통한 제작된 3종의 인간유도만능 줄기세포의 pluripotency 확인.
표 (A)3종의 episomal iPSc 로부터 pluripotent marker인 Oct- 4, SSEA- 4, TRA1- 81 확인. (B)제작된 episomal iPSc의 신경세포로의 분화 유도 및 특성
표 (A) Pro- 1 iPSc 세포주 특성분석. 형태학적 특징 및 marker 발현 분석. Semi- quantitative RT- PCR 분석 (left). Modified 5- stage 분화 방법 및 각 단계별 대표적인 형태학적 특징 (neural rosette의 형성 [ Rosette] , neural precursor [ NP] , 및 mature neuron [ MN] (right). (B) IHC에서 특정 신경세포로의 분화정도를 분석
표 (A) 뇌졸중 동물모델에서 hUC- MSC의 실험 디자인. (B) hUC- MSC 정맥투여 후 뇌경색 크기의유의한 감소를 보임. (C) 4주간의 행동분석 (Rotarod, stepping, mNSS)에서 hUC- MSC 투여군에서 유의한 행동학적 호전이 관찰됨. (D) Evans blue extravarsation 실험에서 hUC- MSC 투여군은 EB extravarsation이 유의하게 감소됨.
표 (A) MCAo 유도 24시간 후 정맥투여된 hUC- MSC의 항염증 조직분석. hUC- MSC 정맥 투여군에서 전 염증형 M1 마크로파지 (iNOS+)의 감소와 항염증형 M2 마크로파지 (CD206+)의 증가를 보임. (B) TUNEL 염 색에서 hUC- MSC 투여군은 3일째 뇌조직내 세포고사의 감소를 나타냄. (C) hUC- MSC 정맥투여군은 4주째 뇌조직내 글리오시스 (GFAP+) 흉터생성을 감소시킴. (D) hUC- MSC 정맥투여의 뇌보호효과의 기전.
표 (A) 지방유래 중간엽줄기세포 (AD- MSC)의 세포특성 확인. (B) 내경동맥(ICA) 내 AD- MSC의 동맥 내 투여. (C) Cy5 염색을 이용한 1일째, 3일째, 7일째 AD- MSC 동맥투여 후 뇌 조직내 세포생착 비교 및 Brain MRI와 Prussian blue염색을 통한 8 주째 세포 생착 확인. (D) hNeu+ DAB 염색을 통한, 8주까지의 뇌내 AD- MSC 세포량 측정 및 신경세포 (MAP2+), 글리아 세포 (GFAP+) 및 혈관내피세포 (PECAM+)으로의 분화 측정.
표 (A)AD- MSC 동맥투여 후 뇌조직내 염증반응 (Iba- 1+/ED- 1+)의 감소. (B) AD- MSC 동맥 투여 후 SVZ내 내인성 신경재생 (BrdU+/DCX+)의 증가. (C) AD- MSC 동맥 투여 후 뇌경색부피 감소 및 뇌교량 부피 증가 (Cresyl violet staining). (D) AD- MSC 동맥 투여 후 8주까지의 행동학적 (Rotarod, mNSS test) 호전
표 Umbilical cord blood- derived stem cell을 neuronal differentiation시켜 90min MCAo rat stroke model의 뇌내 이식을 통하여 행동학적 호전, 혈관신생(angiogenesis) 촉진 및 항염증 (anti- inflammation) 작용과 흉터생성(gliosis)의 감소를 보였음.
표 (A) hPV- MSC에서 RT- PCR 및 면역조직화학검사. Nestin, Sox2, musashi의 발현 및 PDGFR의 발현이 증가됨 (B) hPV- MSC 뇌내 이식 후 MCAo 레트의 행동학적 호전. (c) hPV- MSC 뇌내 이식 후 MRI 및 hNu+ 염색을 통한 이 식 후 뇌내 생착 확인. (D) hPV- MSC 뇌내 이식 후 gliosis (GFAP+) 감소.
표 (A) hPV- MSC에서 이식 8주 후 뇌경색 주변부 미세혈관 밀도 (laminin+)의 증가. (B)hPV- MSC 뇌내 이식 8주 후 SVZ에서의 내인성 신경재생 (BrdU+/DCX+)의 증가가 관찰됨.
표 척수손상에 이용될 수 있는 여러 가지 줄기세포의 특징 정리
표 척수손상 세포치료를 위한 최적의 세포이식방법 비교 분석
표 SCI rat model에서 손상 7일 후 hBM- MSC의 정맥내 (IVT), 병변내 (ILT) 및 척수강 (ICT)내 주입 비교 효능 조사.
표 (A) 태아유래 신경전구세포(F3) 분화. early phase (Sox2, NCAM, nestin+)을 거쳐 late mature neuron (Tuj1, MAP2, darpp32)으로 분화함. (B) 90min MCAo rat model에 F3세포를 이식한 결과 병변부위 로 이식된 세포가 확인 (hNu+, Prussian blue+)되었으며 SVZ에서의 endogenous neurogenesis (BrdU+)가 활성화 됨. (C) 이식 4주 후부터 sham군에 비해 행동학적 호전이 관찰됨. (D) 면역조직염색에서 이식된 세 포에서 MAP2+, TH+, Darpp32+, vWF+인 여러 세포로 분화됨을 관찰함.
표 (A)인간태아 신경줄기세포 (F3 neural stem cell)에 Comp기를 삽입한 Angiopoietin 1 (Ang1)을 LV vector를 이용하여 transfection 시킴. RT- PCR, Western blot 및 in vitro IHC 상에 서 Ang1이 안정적으로 발현함을 확인함. (B) F3.Comp.Ang1을 뇌내 이식 후 8주째 신경세포로의 분화 확인 (nestin+, hNeuN+) 및 8주까지의 행동학적 호전 관찰 (C) F3.Comp.Ang1을 뇌내 이식 후 SVZ에서의 내인성 신경재생능 (BrdU+/DCX+) 확인. (D) 세군에서의 infarct size 비교 결과, F3.Comp.Ang1의 뇌경색 크기가 다른 두군에 비해 유의하게 감소됨.
표 (A)공배양 실험 일정. 공배양 24 시간 후, LPS 로 macrophages 활성화 유도, 24 hour 처리 후, NO　측정. (B) LPS 비처리군과, 처리군으로 나눈 후, control, F3,F3.Comp.Ang1 세군으로 나누어 실험. (C) NO 측정결과, F3.Comp.Ang1과 공배양한 macrophage cell에서 NO concentration의 현저한 감소를 확인함.
표 (A) F3.BDNF 분화, neuronal marker 발현정도 및 BDNF 발현 확인. (B) Intracisternal F3.BDNF 주입 실험 디자인. (C) 10주까지의 행동분석 (BBB score, CBS score, vocalization score) 및 somatosensory evoked potential (SSEP) 결과. (D) Lesion volume (cavitary lesion) 측정.
표 (A) F3.BDNF는 손상된 척수내에서 생착, 올리고덴드로글리아 (O4, MBP)로의 분화가 가능함을 확인. (B) 손상 후 글리아세포에 의해 유도되는 흉터생성 (GFAP+)을 감소시킴. (C) Neuronal tracer인 BDA, FG 등을 투여하여 손상된 척수 내 생착된 세포가 BDA, FG와 merge함을 확인.
표 (A) Olig2 과발현 hUC- MSC의 척수손상모델에서의 이식치료효과 조사 일정. (B) Olig2 과발현 hUC- MSC의 transfection 효율 확인 (C) Olig2 유전자 과발현 hUC- MSC의 Western blot & Real- time PCR 분석 (D) 이식 후 SCI 모델에서 Olig2 과발현 hUC- MSC의 생 착 및 분포도 확인 (E) 조직에서의 Olig2 유전자 과발현 hUC- MSC에서 Olig2의 발현 확인.
표 면역형광염색를 통한 조직 내 Inflammatory marker 확인.
표 세포이식후 기능학적 호전양상 조사 (A) SCI 모델 behavior(vocalization threshold, BBB, CBS) 분석 (B) Electrophysiology (Motor evoked potential)
표 BMSC와 FGF- 2를 분비하는 nanosphere를 함께 이식한 결과.
표 인간유도만능줄기세포 (iPSc)로부터 신경전구세포로 분화 유도후 이를 MCAo 90 분 레트 모델에 이 식후, 행동학적 호전과 이식한 세포의 병변부위로의 이동을 확인하였고, 이 식후 8주차에 조직 분석을 통하여 이식된 세포들이 소수 이지만 mature neuron 으로 분화하였음을 확인하였음. 또한, 항염증 및 흉터생성 억제, 세포괴사의 억제를 이식군에서 확인하였으며 이에 반하는 회복 메커니즘인 BrdU+/DCX+, BrdU+/PSA- NCAM + 세포들의 수가 이식군에서 유의하게 증가하였음.
표 (A) 단백질 유도 만능줄기세포 (Pro1- iPSc)로부터 신경줄기세포로 분화 (Neurosphere method)하여 (Tuj1+/Sox2+/MAP2+) 뇌졸중 동물모델에 이식함. (B) Pro1- iPSc 신경줄기세포 이식 후 8주까지의 행동테스트 (Rotarod, stepping, mNSS, apomorphine test)에서 신경줄기세포 이식군 에서 행동학적 호전이 관찰. (C) 이식된 세포는 뇌내에서 8주까지 생존해 있으며 (hNu+) 신경세포 로 분화함 (Nestin+/Map2+).
표 헌팅턴 환자 유래 인간유도만능줄기세포로부터 신경전구세포로 분화를 유도하였고, 이를 다시 mature neuron 으로 분화시켜서 관련 marker들을 분석하였음. 이러한 mature neuron들이 과연 function 이 있는지 확인하기 위해 patch clamp 실험을 통하여 확인하였음 (A). 또한 이러한 신경전구세포들을 quinolinic- acid 유도 레트 모델에 이식하였고, 행동학적 호전 (B)과 함께 이식한 세포들이 병변 부위 주 위에서 Darpp32, GABA와 같은 medium spiny neuron과 관련된 marker 들을 expression 하는 세포로 분화했음.
표 (A) 뇌졸중 동물모델에서 반대편 striatum에 hES- NPC를 이식하여 56일까지 MRI를 촬영한 결 과, 반대편에 이식된 이식 7일째부터 hES- NPC는 병변부위로 이동함. 이동한 세포는 주로 CXCR4 양성세 포들이었음. Prussian blue 염색에서 이식 8주까지 이식된 세포는 병변주위에 생존함을 Prussian blue염 색으로 확인함. (B) 병변부위로 이동한 세포는 nestin, Tuj- 1, NeuN, TH, Darpp- 32, SVP- 38을 발현하여 기능적인 신경세포로 분화함을 확인. (C) hES- NPC 이식군에서 8주까지 행동학적 호전이 관찰됨.
표 [위] F3.BDNF를 PE- 10튜브를 이용해 손상부위에 전달한 다음 MRI촬영을 시행 함. MRI촬영 전에 세포에 Fe를 tagging하여 MRI촬영시 세포가 뚜렷하게 나오도록 처리함. [아래] 조직검사 상 손상 부위에 잘 생착된 세포들을 관찰할 수 있었음 (red arrow).
표 (A) hUC- MSC의 conditioned medium (CM)에 대한 508종의 사이토카인과 영양인자에 대한단백질체 분석. (B) MSC- CM에서 고농도로 분비하는 top 30 protein list. (C) LPS로 자극된 Raw 247cell line에 MSC- CM 투여 후 IL- 1β와 IL- 1ra ELISA 분석. (D) 뇌졸중 동물모델의 뇌조직에서 hUC- MSC의 IL- 1ra 분비 마크로파지 (ED1+) 증가.
표 (A) Rat stroke model에서 뇌조직 mRNA 마이크로 어레이 분석을 통한 heat map 및 KEGG pathway를 통한 canonical pathway 결과 Toll- like pathway, antigen presentation 관련 유 전체 발현의 변화가 관찰됨. (B) 중간엽줄기세포를 투여한 후 샴군과 마이크로어레이 결과 상 141 개의 유전자 발현차이를 보이고, 이중 IL1RN, GPX2, PTGES 등의 항염증 관련 유전자 및 항세포고 사 관련 유전자들의 발현이 상승됨. (C) 정상군, MCAo군, MCAo 유도 후 중간엽줄기세포 투여군 에서의 뇌조직 사이토카인 발현을 Real time PCR로 분석함. 중간엽줄기세포 투여군은 전염증 사이 토카인 (IL- 1β, TNF- α, MMP- 9)의 발현을 감소시키고, 항염증 사이토카인 (IL- 1RN)등의 발현을 증 가시켰음.
표 허혈성 뇌졸중 환자의 혈액 내 whole blood transcriptome microarray 분석.
표 허혈성 뇌졸중 환자에서 12종의 혈중 단백질 농도분석 결과.
표 탯줄유래 중간엽줄기세포 (Cordstem- ST) 용량설정 및 반복투여 효능분석 전임상 시험.
표 허혈성 뇌졸중 환자 대상 탯줄줄기세포 정맥투여 임상시험을 위한 환자선정/제외 기준 및 투여 시기및 용량결정을 위한 자료집.
표 전임상 자료를 바탕으로 한 척수손상 환자를 대상으로 중간엽줄기세포 척수강내 주입치료법에 대한 임상시험 계획 수립.
표 연구결과물 해외학술대회 발표 현황
표 탯줄유래 중간엽줄기세포 임상시험용 IND filing을 위한 안전성, 효력시험 Time table
표 종료 2년 이내 예상되는 학술적, 기술적 성과
표 신경줄기세포 (유전자 도입 혹은 배아 유래)에서의 뇌졸중, 척수손상 임상 현황
표 (A) MCAo rat에서 hUC- MSC의 실험 디자인. (B) hUC- MSC 정맥투여 후 뇌경색 크기의 유의한 감소를 보임. (C) 4주간의 행동분석 (Rotarod, stepping, mNSS)에서 hUC- MSC 투여군에 서 유의한 행동학적 호전이 관찰됨. (D) Evans blue extravarsation 실험에서 hUC- MSC 투여군 은 EB extravarsation이 유의하게 감소됨.
표 (A) MCAo 유도 24시간 후 정맥투여된 hUC- MSC의 항염증 조직분석. hUC- MSC 정맥 투여군에 서 전염증형 M1 마크로파지 (iNOS+)의 감소와 항염증형 M2 마크로파지 (CD206+)의 증가를 보임. (B) TUNEL 염색에서 hUC- MSC 투여군은 3일째 뇌조직내 세포고사의 감소를 나타냄. (C) hUC- MSC 정맥투 여군은 4주째 뇌조직내 글리오시스 (GFAP+) 흉터생성을 감소시킴. (D) hUC- MSC 정맥투여의 뇌보호효 과의 기전.
표 (A) 지방유래 중간엽줄기세포 (AD- MSC)의 세포특성 확인. (B) 내경동맥(ICA) 내 AD- MSC 의 동맥 내 투여. (C) Cy5 염색을 이용한 1일째, 3일째, 7일째 AD- MSC 동맥투여 후 뇌조직내 세포 생착 비교 및 Brain MRI와 Prussian blue염색을 통한 8 주째 세포 생착 확인. (D) hNeu+ DAB 염색을 통한, 8주까지의 뇌내 AD- MSC 세포량 측정 및 신경세포 (MAP2+), 글리아세포 (GFAP+) 및 혈 관내피세포 (PECAM+)으로의 분화 측정.
표 (A)　AD- MSC 동맥투여 후 뇌조직내 염증반응 (Iba- 1+/ED- 1+)의 감소. (B) AD- MSC 동맥 투여 후 SVZ내 내인성 신경재생 (BrdU+/DCX+)의 증가. (C) AD- MSC 동맥 투여 후 뇌경색부피 감소 및 뇌교량 부피 증가 (Cresyl violet staining). (D) AD- MSC 동맥 투여 후 8주까지의 행동학적 (Rotarod, mNSS test) 호전
표 Umbilical cord blood- derived stem cell을 neuronal differentiation시켜 90min MCAo rat stroke model의 뇌내 이식을 통하여 행동학적 호전, 혈관신생(angiogenesis) 촉진 및 항염증 (anti- inflammation) 작용과 흉터생성(gliosis)의 감소를 보였음.
표 (A) 단백질 유도 만능줄기세포 (Pro1- iPSc)로부터 신경줄기세포로 분화 (Neurosphere method)하여 (Tuj1+/Sox2+/MAP2+) 뇌졸중 동물모델에 이식함. (B) Pro1- iPSc 신경줄기세포 이식 후 8주까지의 행동테스트 (Rotarod, stepping, mNSS, apomorphine test)에서 신경줄기세포 이식군에서 행동학적 호전이 관찰. (C) 이식된 세포는 뇌내에서 8주까지 생존해 있으며 (hNu+) 신경세포로 분화함 (Nestin+/Map2+).
표 (A) 뇌졸중 동물모델에서 반대편 striatum에 hES- NPC를 이식하여 56일까지 MRI를 촬영한 결 과, 반대편에 이식된 이식 7일째부터 hES- NPC는 병변부위로 이동함. 이동한 세포는 주로 CXCR4 양 성세포들이었음. Prussian blue 염색에서 이식 8주까지 이식된 세포는 병변주위에 생존함을 Prussian blue염색으로 확인함. (B) 병변부위로 이동한 세포는 nestin, Tuj- 1, NeuN, TH, Darpp- 32, SVP- 38를 발현하여 기능적인 신경세포로 분화함을 확인. (C) hES- NPC 이식군에서 8주까지 행동학적 호전이 관 찰됨.
표 (A) Rat stroke model에서 뇌조직 mRNA 마이크로 어레이 분석을 통한 heat map 및 KEGG pathway를 통한 canonical pathway 결과 Toll- like pathway, antigen presentation 관련 유전체 발현 의 변화가 관찰됨. (B) 중간엽줄기세포를 투여한 후 샴군과 마이크로어레이 결과 상 141개의 유전자 발현차이를 보이고, 이중 IL1RN, GPX2, PTGES 등의 항염증 관련 유전자 및 항세포고사 관련 유전자 들의 발현이 상승됨. (C) 정상군, MCAo군, MCAo 유도 후 중간엽줄기세포 투여군에서의 뇌조직 사 이토카인 발현을 Real time PCR로 분석함. 중간엽줄기세포 투여군은 전염증 사이토카인 (IL- 1β, TNF- α, MMP- 9)의 발현을 감소시키고, 항염증 사이토카인 (IL- 1RN)등의 발현을 증가시켰음.
표 (A) RayBio􎼿 Biotin label- based human antibody array을 이용한 hUC- MSC의 conditioned medium (CM)에 대한 508종의 사이토카인과 영양인자에 대한 프로테옴 분석. (B) 프로테옴 분석에서 MSC- CM에서 고농도로 분비하는 top 30 protein list. (C) LPS로 자극된 Raw 247 cell line에 MSC- CM 투여 후 IL- 1β와 IL- 1ra ELISA 분석. (D) 뇌졸중 동물모델의 뇌조직에서 hUC- MSC의 IL- 1ra 분비 마크로파지 (ED1+) 증가.
표 허혈성 뇌졸중 환자의 혈액 내 whole blood transcriptome microarray 분석.
표 허혈성 뇌졸중 환자에서 12종의 혈중 단백질 농도분석 결과.
표 탯줄유래 중간엽줄기세포 용량설정 및 반복투여 효능분석 전임상 시험.
표 허혈성 뇌졸중 환자 대상 탯줄줄기세포 정맥투여 임상시험을 위한 환자선정/제외 기준 및 투여 시기 및용량결정을 위한 자료집.
표 영화 슈퍼맨의 배우 Christopher Reeve.
표 백서에서 bone marrow stromal cell을 이식한 그룹이 PBS를 이식한 그룹보다 BBB score가 우수하였다 (Chopp 2002).
표 Yamanaka 교 수의 iPSc
표 NYU 충격기를 이용한 실험 모습.
표 [좌] CBS score를 측정한 백서의 부위. [우]기계적 이질통을 자동으로 측정하는 자동 Von Frey Hair 측정기.
표 백서의 SSEP와 MEP를 측정하는 실험.
표 뇌수조내주입법으로 BMSC를 이식하고 2주후 얻은 척수의 시상 단면. AHNA염색,DAPI염색, 병합 이미징 기법이 이용되었음.
표 척수손상에 이용될 수 있는 여러 가지 줄기세포의 특징 정리
표 척수손상 세포치료를 위한 최적의 세포이식방법 비교 분석
표 SCI rat model에서 손상 7일 후 hBM- MSC의 정맥내 (IVT), 병변내 (ILT) 및 척수강 (ICT)내주입 비교 효능 조사.
표 (A) F3.BDNF 분화, neuronal marker 발현정도 및 BDNF 발현 확인.(B) Intracisternal F3.BDNF 주입 실험 디자인. (C) 10주까지의 행동분석 (BBB score, CBS score, vocalization score) 및 Somatosensory evoked potential (SSEP) 결과. (D) Lesion volume (cavitary lesion) 측정.
표 (A) 척수손상 후 척수강내로 투여된 F3.BDNF는 손상된 척수내에서 생착, 올리고덴드로글리아 (O4, MBP)로의 분화가 가능함을 확인. (B) 손상 후 글리아세포에 의해 유도되는 흉터생성 (GFAP+)을 감소시킴. (C) Neuronal tracer인 BDA, FG 등을 투여하여 손상된 척수 내 생착된 세포가 BDA, FG와 merge함을 확인.
표 (A) Olig2 과발현 hUC- MSC의 척수손상모델에서의 이식치료효과 조사 일정. (B) Olig2 과발현 hUC- MSC의 transfection 효율 확인 (C) Olig2 유전자 과발현 hUC- MSC의 Western blot & Real- time PCR 분석 (D) 이식 후 SCI 모델에서 Olig2 과 발현 hUC- MSC의 생착 및 분포도 확인 (E) 조직에서의 Olig2 유전자 과발현 hUC- MSC에서 Olig2의 발현 확인.
표 면역형광염색를 통한 조직 내 Inflammatory marker 확인.
표 세포이식후 기능학적 호전양상 조사
표 BMSC와 FGF- 2를 분비하는 nanosphere를 함께 이식한 결과.
표 [위] F3.BDNF를 PE- 10튜브를 이용해 손상부위에 전달한 다음 MRI촬영을 시행함. MRI촬영 전에 세포에 Fe를 tagging하여 MRI촬영시 세포가 뚜렷하게 나오도록 처리함.[아래] 조직검사 상 손상 부위에 잘 생착된 세포들을 관찰할 수 있었음.
표 전임상 자료를 바탕으로 한 척수손상 환자를 대상으로 중간엽줄기세포 척수강내 주입 치료법에 대한 임상시험 계획 수립.
표 Establish되어진 3종의 인간유도만능줄기세포: 3 종의 유도만능줄기세포로부터 pluripotency marker인 Oct- 4, Nanog 등의 expression 확인.
표 제작된 3종의 유도만능 줄기세포로부터 qRT- PCR을 통한 Oct- 4, Sox2의 endogene 발현 확인.
표 EB differentiation method를 통한 제작된 3종의 인간유도만능 줄기세포의 pluripotency 확인.
표 Episomal vector를 이용한 integration- free iPSc 제작방법 및 제작 과정.
표 3종의 episomal iPSc 로부터 pluripotent marker인 Oct- 4, SSEA- 4, TRA1- 81 확인.
표 제작된 episomal iPSc의 신경세포로의 분화 유도 및 특성
표 Pro- 1 iPSc 세포주 특성분석. 형태학적 특징 및 marker 발현 분석. Semi- quantitative RT- PCR 분석: Oct4 및 Nanog mRNA 발현이 높음을 나타내줌. 면역세포학적 분석: pluripotency marker인 OCT4, SSEA- 4, TRA- 1- 81이 발현됨을 나타내줌.
표 Pro- 1 세포의 신경세포 분화 유도.
표 immunocytochemical staining을 통해 특정 신경세포로의 분화정도를 분석
표 Sendai virus를 이용하여 제작된 인간말초혈액유래 유도만능줄기세포
표 4D Nucleofactor electroporation 이용하여 제작된 헌팅턴병 환자의 말초혈액유래 유도만능줄기세포
표 인간유도만능줄기세포로부터 신경전구세포로 분화 유도후 이를 MCAo 90 분 레트 모델에 이 식후, 행동학적 호전과 이식한 세포의 병변부위로의 이동을 확인하였고, 이 식후 8주차에 조직 분석을 통하여 이식된 세포들이 소수 이지만 mature neuron 으로 분화하였음을 확인하였음. 또한, 항염증 및 흉터생성 억제, 세포괴사의 억제를 이식군에서 확인하였으며 이에 반하는 회복 메커니즘 인 BrdU+/DCX+, BrdU+/PSA- NCAM + 세포들의 수가 이식군에서 유의하게 증가하였음.
표 헌팅턴 환자 유래 인간유도만능줄기세포로부터 신경전구세포로 분화를 유도하였고, 이 를 다시 mature neuron 으로 분화시켜서 관련 marker들을 분석하였음. 이러한 mature neuron들 이 과연 function 이 있는지 확인하기 위해 patch clamp 실험을 통하여 확인하였음 (A). 또한 이 러한 신경전구세포들을 quinolinic- acid 유도 레트 모델에 이식하였고, 행동학적 호전 (B)과 함께 이식한 세포들이 병변 부위 주위에서 Darpp32, GABA와 같은 medium spiny neuron과 관련된 marker 들을 expression 하는 세포로 분화한 것을 확인했음.
표 (A) hPV- MSC에서 RT- PCR 및 면역조직화학검사. RT- PCR에서 Nestin, Sox2, musashi의 발현 및 면역조직검사에서 hNestin, hPDGFR의 발현이 증가됨 (B) hPV- MSC 뇌내 이식 후 MCAo 레트 행동학적 호전. (c) hPV- MSC 뇌내 이식 후 MRI 및 hNu+ 염색을 통한 이식 8주 후 뇌내 생착 확인. (D) hPV- MSC 뇌내 이 식 후 gliosis (GFAP+) 감소.
표 (A) hPV- MSC에서 이식 8주 후 뇌경색 주변부 미세혈관 밀도 (laminin+)의 증가. (B) hPV- MSC 뇌내 이식 8주 후 SVZ에서의 내인성 신경재생 (BrdU+/DCX+)의 증가가 관찰됨.
표 (A) BDNF 과발현 신경줄기세포 (F3.BDNF)의 분화. early phase (Sox2, NCAM, Nestin+)을 거쳐 late mature neuron (Tuj- 1, MAP2, Darpp- 32)으로 분화함. (B) 90min MCAo rat model에 F3세포를 이식한 결과 병변부위로 이식된 세포가 확인 (hNu+, Prussian blue+)되었으며 SVZ에서의 endogenous neurogenesis (BrdU+)가 활성화 됨. (C) 이식 4주 후부터 sham군에 비해 행동학적 호전이 관찰됨. (D) 면역조직염색에서 이 식된 세포에서 MAP2+, TH+, Darpp- 32+, vWF+인 여러 세포로 분화됨을 관찰함.
표 (A)　인간태아 신경줄기세포 (F3 neural stem cell)에 Comp기를 삽입한 Angiopoietin 1 (Ang1)을 LV vector를 이용하여 transfection 시킴. RT- PCR, Western blot 및 in vitro IHC 상에서 Ang1이 안정적으로 발현함을 확인함. (B) F3.Comp.Ang1을 뇌내 이식 후 8주째 신경세포로의 분화 확인 (Nestin+, hNeuN+) 및 8주까지의 행동학적 호전 관찰 (C) F3.Comp.Ang1을 뇌내 이식 후 SVZ에서의 내인성 신경재생능 (BrdU+/DCX+) 확인. (D) 세군에서의 infarct size 비교 결과, F3.Comp.Ang1의 뇌경색 크기가 다른 두군에 비해 유의하게 감소됨.
표 (A)　공배양 실험 일정. 공배양 24 시간 후, LPS 로 macrophages 활성화 유도, 24 hour 처리 후, NO　 측정. (B) LPS 비처리군과, 처리군으로 나눈 후, control, F3, F3.Comp.Ang1 세군으로 나누어 실험. (C) NO 측정결과, F3.Comp.Ang1과 공배양한 macrophage cell에서 NO concentration의 현저한 감소를 확인함.

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뇌졸중 및 척수손상 동물모델에서 임상적용가능 줄기세포의 이식치료법 개발을 위한 전임상 연구
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