초록 ▼

○ 연구결과
제 1세부과제 : 미생물 복합발효에 의한 항산화성 생리활성물질의 생산 특성
미생물 복합발효에 의한 항산화성 물질의 생산 특성을 조사하기 위하여 발효식품등에서 항산화 활성이 우수한 균주를 최종 4종을 분리하였다. 이들을 조합하여 발효특성에 따른 혼합균주를 Bacillus B6, Acetobacter A6 및 Saccharomyces S1의 3종를 혼합발효한 배양물이 높은 항산화 활성이 나타났다. 이들 균주를 이용한 배양물의 특성을 조사한 결과 당밀 2%, 쌀추출물 0.5 °brix 및 부원료로 미강추출물 5%를

○ 연구결과
제 1세부과제 : 미생물 복합발효에 의한 항산화성 생리활성물질의 생산 특성
미생물 복합발효에 의한 항산화성 물질의 생산 특성을 조사하기 위하여 발효식품등에서 항산화 활성이 우수한 균주를 최종 4종을 분리하였다. 이들을 조합하여 발효특성에 따른 혼합균주를 Bacillus B6, Acetobacter A6 및 Saccharomyces S1의 3종를 혼합발효한 배양물이 높은 항산화 활성이 나타났다. 이들 균주를 이용한 배양물의 특성을 조사한 결과 당밀 2%, 쌀추출물 0.5 °brix 및 부원료로 미강추출물 5%를 첨가한 배양물이 우수한 항산화 활성이 나타났다.
항산화력이 높은 발효조건을 설정하기 위하여 발효액 및 배양조건별 총 페놀성 화합물 함량 및 전자공여능에 대한 발효특성을 조사하고 이들 값의 반응표면을 superimposing하여 최적 발효액 조건 범위를 예측한 결과 발효액의 총 페놀성 화합물 함량 및 전자공여능이 모두 만족하는 범위는 당밀 첨가량 1.8～2.2%, 미강 첨가량 2.1～2.4% 및 탈지대두박 첨가량 1.9～2.4%로 나타났고 최적 발효조건의 범위는 발효온도 25～35℃, 발효시간 10～14일, 발효초기 pH 5.5～7.5이었다. 그리하여 이로부터 최적점이라고 예상되는 발효온도 30℃, 발효시간 12일, 발효초기 pH 6.5를 최적의 발효조건으로 예측되었다.
배양액의 용매 분획물의 항산화적 특성을 조사한 결과 총 페놀 화합물 함량은 methanol/water 분획이 117.50 mg%으로서 가장 높은 함량이었다. 아질산염소거능 측정결과 methanol/water 분획과 n-butanol분획에서 각각 94.81%, 92.61%의 높은 활성을 나타내었다. DPPH법 및 DMPD법에 의한 배양액의 전자공여능 실험결과 methanol/water 분획에서 각각 96.53%, 및 73.07%으로 가장 높은 활성을 나타내었다.
발효액 추출물 및 중성 페놀물질과 산성 페놀물질을 분획하여 C18 reverse phase HPLC 분석 및 TLC에서 분리를 행한 결과 발효액에서의 phenolic acid는 중성획분에서 추출되며, 주요 페놀성분은 ferulic acid와 sinapic acid로 밝혀졌다.
발효액으로부터 추출한 추출물의 중성 획분과 산성 획분의 총 페놀성 화합물, 아질산염 소거능 및 전자공여능을 측정한 결과 아질산염 소거능은 각각 98.29%, 89.29%로 강한 활성을 나타내었고, 총 페놀성 화합물 함량은 중성 획분에서 월등히 높은 함량(141.75 mg%)을 보였다. 전자공여능은 DPPH법의 경우 중성획분에서 97.70%의 높은 활성을 나타냈으며, DMPD 법에서도 중성획분의 전자공여능 활성이 가장 좋았다. 발효액의 전자공여능은 중성획분이 산성획분 보다 항산화 효과가 훨씬 큰 것으로 나타났다.
발효배양액의 수용성 갈변물질 중 투석내액 물질 및 DEAE-cellulose 칼럼 분획들의 항산화력을 측정한 결과 투석 외액물질 및 DEAE-cellulose 칼럼 분획들의 항산화능은 투석 내액물질 보다 높은 활성을 보였으며, 투석 외액물질은 DPPH radical 소거능이 92.25%, 총 페놀성 화합물 함량 289.50 mg%로 상당히 높은 값을 보였다. DEAE-cellulose 칼럼 분획 중 0.01M 초산 완충액에서 전자공여능(DPPH radical 소거능)이 81.32%로 높은 활성을 나타내어 0.01M 초산완충 분획에서 항산화능을 가진 수용성 갈변물질이 분리되는 것으로 보였다.
수용성 갈변물질 구분의 투석 내액물질 구분과 투석 외액물질 구분을 DEAE-cellulose 칼럼으로 분획하고 각 분획분으로 박층 크로마토그래피를 실시한 결과 투석 내액물질 구분의 분리에서는 분획분으로부터 치 0.02 M HCl Rf 0.2와 0.35의 2개 구분으로 분리되었으며, 투석 외액물질 구분의 분리에서는 0.01 M AcOH용액 분획분으로부터 Rf치 0.28과 0.45의 2개의 구분이 각각 분리되었다.
최종 선별된 9종의 변이균주를 대상으로 한 항산화 활성을 비교한 결과 전자공여능(DPPH, DMPD, ABTS radical 소거능) 및 아질산염 소거능 활성에서 M1 변이주의 경우 모든 항산화 활성이 모균주보다 높은 것으로 나타나 모균주 및 변이주 M1을 대상으로 primer를 제작하고 항산화성 물질 합성에 관여하는 유전자 단편을 클로닝 하였다.
SRB assay를 통한 암세포 성장억제효과의 검사에서 6가지 시료추출물 중 ether fraction, chloroform fraction과 ethylacetate fraction은 대조군에 비하여 농도 의존적으로 암세포 성장을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 3 시료 ether fraction, chloroform fraction과 ethylacetate fraction 3시료에 대하여 Trypan blue exclusion assay를 통한 암세포 성장 억제효과를 확인한 결과 시료의 농도가 증가 할수록 사멸한 세포의 수가 증가하였으며, 생존 세포의 수도 대조군에 비하여 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 시료 추출물 ether fraction, chloroform fraction과 ethylacetate fraction IC50 각각의 값은 0.84±0.079, 0.94±0.017, 0.8±0.03으로 나타났다.
제 2세부과제 : 미생물 복합발효 배양물의 피부 적용성과 화장품 제품개발
미생물 복합 발효 배양액의 인체에 대한 세포 독성 및 피부 1차 자극성 평가, 피부 감작성 평가를 관찰한 결과, 세포 독성은 SLS에 비하여 2,000배 이상 세포 독성이 낮은 것으로 관찰되었으며, 피부 감작성 평가에서는 증폭 정도(SI)가 3이하로서 알러지 유발 가능성이 없는 것으로 관찰되었다. 또한 CTFA 가이드라인에 따라 실시한 인체첩포 시험은 미생물 복합 발효 배양액 5%(v/v)의 인체 도포시 자극이 없는 안전한 원료인 것으로 관찰되었다.
미생물 복합 발효 배양액의 피부 각질제거 효과를 관찰한 결과, 약 32.1%의 각질제거 효과가 있는 것으로 관찰되었으며, 피부 보습력 평가에서는 화장품 제조시 보습제로 많이 사용되고 있는 glycerin, 1,3-butylene glycol, propylene glycol과 거의 유사한 보습력을 가지는 것으로 관찰되었다
미생물 복합 발효 배양액의 항산화 작용에 의한 피부 주름개선 효과 즉, 자유라디칼 소거 활성화 및 세포 활성화, 콜라겐 합성, 엘라스타제 활성 저해 효과, UVA에 의한 MMP-1 발현 저해효과에 대해 배양 전 시료와 비교 관찰해 본 결과, 자유라디칼 소거 활성화능은 약 9배 가량 우수한 것으로 관찰되었으며, 세포활성화능은 약 12배, 콜라겐 합성능은 약 6배 가량 우수한 것으로 관찰되었다.
미생물 복합 발효 배양액의 피부 미백 효과에 대해 관찰한 결과, 약 68%의 tyrosinase 활성 저해율이 관찰되었고 66.9%의 L-DOPA 자동산화억제 효과를 가지고 있는 것으로 관찰되었다. 그리고 69.3% 정도의 B-16 melanoma 내의 melanin 생성을 억제하는 것으로 나타났으며 인공 색소침착을 유도한 시험자들을 대상으로 관찰한 결과 통계학적으로 유의한(p<0.05) 미백효과를 가지는 것으로 관찰되었다.
1%의 미생물 복합 발효 배양액을 함유하는 liquid crystal 제형과 microcapsule 제형을 제조하여 광학 현미경으로 관찰 한 결과, 제형이 완성된 것을 확인할 수 있었고 liquid crystal 제형의 물성은, 25℃ 일 때 pH가 6.73 ± 0.08이었고, 점도는 7,530 ± 460 cP로 나타났으며, microcapsule 제형의 pH는 6.56 ± 0.12이었고, 점도는 19,650 ± 500cP으로 관찰되었다. 이들 값은 일반적인 화장품의 물성과 유사한 수치를 가지는 것 수치이다. 온도 변화(0℃, 25℃, 40℃)에 따른 30일간의 물성 변화를 관찰한 결과, pH 및 점도가 크게 변화하지 않은 것으로 관찰되어 안정성 면에서 매우 우수한 것으로 판단되었다. 또한 일반시험 및 특수ㆍ가혹시험을 실시한 결과, 두 제형 모두상의 분리 및 변색, 변취 등의 물성적 변화가 나타나지 않아 안정한 제형임을 확인할 수 있었다.
협동연구과제 : 미생물 복합발효 배양물의 항산화성 생리 활성적 특성 검증
미생물 복합 발효 배양액의 섭취 수준에 따라 혈중 및 간의 지질함량과 간의 항산화효소 및 지질과산화물 함량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Sprague-Dawley 수컷 쥐를 대상으로 농도가 다른 미생물 복합발효 배양액 함유수(10 mg%, 20 mg%, 30 mg%, 50 mg%)를 6주간 공급한 실험결과를 요약하면 다음과 같다.
1. 미생물 복합발효 배양액의 섭취 유무와 섭취수준이 6주간의 체중증가 패턴과 체중증가량 및 평균 식이섭취량과 식이효율에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
2. 혈청 중성지방의 수치는 미생물 복합발효 배양액을 섭취한 10 mg%군과 20 mg%군이 대조군에 비하여 유의적으로 낮았다. 30 mg%군과 50 mg%군도 대조군에 비하여 낮은 경향이었으나 유의적인 차이는 없었다. 혈청 총 콜레스테롤 수치는 대조군에 비하여 미생물 복합발효 배양액을 섭취한 네 실험 군들에서 유의적으로 낮게 나타났으며, 미생물 복합발효 배양액의 희석 농도에 따른 실험 군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 혈청 HDL-콜레스테롤 수치는 총콜레스테롤 수준이 낮았던 복합 미생물 배양액을 섭취한 네 군이 대조군 보다 유의적으로 낮았으며, 배양액을 섭취한 실험 군 중에서도 50 mg%군이 나머지 세 군 보다 유의적으로 낮았다. 그러나 총 콜레스테롤 중 HDL 콜레스테롤이 차지하는 비율은 실험 군들 간에 유의적인 차이가 없었다. 혈청LDL-콜레스테롤 수치는 대조군에 비하여 총콜레스테롤 수준이 현저히 낮았던 실험 군들에서 유의적으로 낮은 경향을 나타내었으며, 50 mg%군은 대조군 보다 유의적으로 낮게 나타났으며, 동맥경화지수(atherogenic index)는 실험 군들 간에 유의적인 차이가 없었다.
3. 간 중성지방과 총콜레스테롤 농도는 대조군과 실험 군들 간에 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
4. 간 조직의 SOD 활성도는 20%군이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였으며, 나머지 실험군들은 유의적인 차이가 없었다. 간 조직의 catalase 활성도는 30%군과 50%군이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 간 조직의 GSH-Px 활성도는 10%군이 가장 높게 나타났으며, 희석농도가 진할수록 낮아지는 경향을 보여 50%군은 10%군에 비하여 유의적으로 감소하였다.
5. 혈액에서의 MDA 수준은 50%군에서 유의적으로 감소하였으며, 간 조직의 MDA 수준은 대조군과 실험 군 간에 유의적인 차이가 없었으며, 실험군 간에도 미생물 복합발효 배양액의 섭취 수준에 따른 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
미생물 복합발효 배양액 섭취가 혈청 중성지질에 미치는 효과는 섭취 수준에 따라 그 효과가 다르게 나타났다. 배양액 희석 농도가 30%와 50%군 보다 10%, 20%군이 혈청 중성지질을 낮추는데 효과적이었으며. 혈청 총콜레스테롤 수치를 감소시키는데 있어서는 미생물 복합발효 배양액의 섭취 수준에 상관없이 모두 유효한 것으로 나타났으며, 유의적인 차이는 없었으나 20%군과 50%군이 더 낮은 경향이었다.
당뇨쥐에서 미생물 복합 발효 배양액의 섭취 수준에 따라 혈중 및 간의 지질함량과 간의 항산화효소 활성 및 혈장 아미노산 농도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Sprague-Dawley 수컷쥐를 대상으로 농도가 다른 미생물 복합발효 배양액 함유수(20%, 30%)를 4주간 공급 한 실험결과를 요약하면 다음과 같다.
1. 당뇨 쥐에서는 식이섭취량 증가 현상과 함께 체중감소 현상이 나타나 정상군들에 비하여 당뇨군들에서 식이효율이 낮게 나타났다. 당뇨군 내에서는 30%군의 최종 체중이 가장 높게 나타났다.
2. 혈청 중성지방의 수치는 당뇨상태와 정상시 모두 미생물 복합발효 배양액을 섭취로 혈중 중성지방수치가 낮아졌으며, 20%군 보다 30%군에서 더욱 낮았다. 혈청 총 콜레스테롤 수치는 당뇨-대조군의 값이 가장 높았으며, 정상-30%군의 값이 가장 낮았다. 당뇨군내에서는 대조군에 비하여 20%군이 유의적으로 낮았으며, 20%군 보다 30%군이 유의적으로 낮아 당뇨시 30%섭취군의 혈중 콜레스테롤 강하효과가 가장 큰 것으로 나타났다. 정상군들 내에서도 이와 같은 경향으로 나타났다. 같은 식이섭취 조건에서 정상군과 당뇨군을 비교해 보면 당뇨군이 대조군에 비하여 혈중 콜레스테롤 수치가 높은 것으로 나타났다. 혈청 HDL-콜레스테롤 수치는 당뇨와 정상의 경우 모두에서 대조군에 비하여 30%군들의 HDL-콜레스테롤 수준이 유의적으로 높았다. 20%군들도 대조군 보다 높은 경향이었으나 유의적인 차이는 없었다. 혈청 LDL-콜레스테롤 수치는 정상과 당뇨상태에서 각각 대조군, 20%군, 30%군의 순으로 낮게 나타났다. 정상-30%군이 가장 낮았으며, 당뇨-대조군이 가장 높았다. 대조식이, 미생물 복합발효 배양액 20% 섭취와 미생물 복합발효 배양액 30% 섭취에서 각각 정상시 보다 당뇨시에 혈청 혈청 LDL-콜레스테롤 수치는 정상과 당뇨상태에서 각각 대조군, 20%군, 30%군의 순으로 낮게 나타났다. 정상-30%군이 가장 낮았으며, 당뇨 대조군이 가장 높았다. 대조식이, 미생물 복합발효 배양액 20% 섭취와 미생물 복합발효 배양액 30% 섭취에서 각각 정상시 보다 당뇨시에 혈청 LDL-콜레스테롤 수치가 높아지는 것으로 나타났다. Atherogenic index를 보면, 당뇨-대조군의 값이 다른 5군들 보다 유의적으로 높았으며, 당뇨시 증가된 수치는 20%와 30% 미생물 배양액 섭취로 유의적으로 감소하였다. 정상 쥐들에서도역시 미생물 배양액의 섭취로 atherogenic index 값을 낮출 수 있었고 6군 들 중에서 정상-30%군의 Atherogenic index값이 유의적으로 가장 낮았다.
3. 간 중성지방은 당뇨 유무와 복합 미생물 배양액 섭취에 따른 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 간의 총콜레스테롤 농도는 당뇨와 정상 쥐에서 모두 복합 미생물 배양액 섭취군에서 낮게 나타났다.
4. 간 조직의 SOD 활성도는 정상군 중 발효액 30%섭취 군이 가장 높았으며, 당뇨군 중 발효액을 섭취하지 않은 군이 가장 활성이 낮은 것으로 나타났다. 정상군 내에서는 발효액 섭취량이 많을수록 간에서의 SOD 활성도가 높은 것으로 나타났다. 당뇨군에서도 이와 유사한 경향으로 나타났다. 간 조직의 catalase 활성도는 당뇨 유무와 복합 미생물 배양액 섭취에 따른 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 간 조직의 GSH-Px 활성은 정상쥐와 당뇨쥐에서 대조군 보다 미생물 복합발효 배양액을 섭취한 20%와 30%군이 유의적으로 활성이 높게 나타났으며, 30%군이 20% 군 보다 유의적으로 활성이 높게 나타났다.
5. 혈장 유리 아미노산 농도결과는, Taurine, Threonine, Glycine, Citrulline, Cystine, Methionine, Tyrosine, Ornithine, Lysine과 Histidine의 농도는 당뇨 발생 여부와 미생물 복합발효 배양액의 섭취 유무와 섭취 수준에 따른 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. Glutamic acid와 Alanine 농도는 당뇨-30%군이 가장 높았으며, Valine, Leucine, Isoleucine과
Phenylalanine 농도는 당뇨-대조군이 당뇨-20%와 30%군 보다 유의적으로 낮았다. Arginine은 당뇨 대조군이 당뇨-20%와 30%군 보다 낮았으며, 당뇨-20%군이 당뇨-30%군 보다 낮은 값이었으나 유의적이지는 않았다.
미생물 복합발효 배양액 섭취로 당뇨시 증가한 혈 중 총 콜레스테롤을 감소시켰다. 이와 함께 혈청 LDL-콜레스테롤 수치는 낮추고 HDL-콜레스테롤 수치는 높였으며 atherogenic index값을 낮추었으므로 미생물 복합발효 배양액의 섭취는 당뇨로 인한 심혈관계 질환에 대한 발병 위험을 낮추는데 유익할 것으로 사료되며, 그 효과는 30% 희석액 섭취 군에서 가장 높은 것으로 나타났다.
미생물 복합발효 배양액이 체내 항산화계에 미치는 효과는 1차 때와는 달리 정상상태와 당뇨상태의 경우 모두에서 20% 군과 30% 군에서 SOD와 GSH-Px의 활성도가 증가하였다.
당뇨쥐에서 미생물 복합 발효 배양물의 섭취 수준에 따라 혈중 및 간의 지질함량과 간의 항산화효소 활성 및 혈장 유리아미노산 농도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 당뇨 유발 수컷 쥐를 대상으로 미생물 복합발효배양물인 methanol 분획물 1%, 메탄올 분획물 3%, 순수분리물 0.2%를 4주간 공급하여 항산화성 생리활성적 특성을 검증하였다. 실험결과를 요약하면 다음과 같다.
1. 체중증가량은 정상군내에서는 유의적인 차이가 없었고 당뇨군의 체중증가량은 정상군보다 유의적으로 낮았다. 평균 식이 섭취량은 당뇨군이 정상군보다 유의적으로 높았고 식이효율은 당뇨군이 정상군보다 유의적으로 낮았다.
2. 4주간의 혈당수준은 당뇨군이 정상군보다 유의적으로 높게 나타났다. 정상군에서는 4주간의혈당 수준은 유의적인 차이가 없었고 당뇨군내에서는 순수분리물 0.2%군이 가장 높았고 메탄올 분획물 3%군이 낮은 경향을 보였다.
3. 공복시 혈당은 당뇨군이 정상군보다 전반적으로 높았으나 정상군과 당뇨군간에 유의적인 차이가 없었다. 정상군과 당뇨군내에서 각각 메탄올 분획물 3%군이 유의적인 차이는 아니지만 공복시 혈당이 가장 낮게 나타났다. 인슐린농도는 당뇨군내에서 메탄올 분획물 3%군이 유의적인 차이는 아니지만 가장 높게 나타났고 정상군내에서는 순수분리물 0.2%군이 유의적으로 인슐린 농도를 증가시켰다.
4. 혈중 총콜레스테롤 농도는 당뇨군내에서 메탄올 분획물 1%군보다 메탄올 분획물 3%군과 순수분리물 0.2%군이 유의적으로 낮게 나타났다. 혈중 중성지방 농도는 당뇨군내에서 메탄올 분획물 3%군과 순수분리물 0.2%군이 유의적으로 낮았다. 혈중 HDL- 콜레스테롤 농도는 당뇨군내에서 실험식이에 따른 유의적인 차이가 없었으나 메탄올 분획물 3%군과 순수분리물 0.2%군이 대조군과 메탄올 분획물 1%군보다 높은 경향을 나타내었다. 혈중 LDL-콜레스테롤 농도는 정상군과 당뇨군 모두에서 메탄올 분획물 3%군과 순수분리물 0.2%군이 대조군과 메탄올 분획물 1% 군보다 유의적으로 낮게 나타났고 당뇨군내에서는순수분리물 0.2%군이 유의적으로 가장 낮았다.
동맥경화지수(athrogenic index)는 정상군과 당뇨군 모두에서 메탄올 분획물 3%군과 순수분리물 0.2%군이 대조군과 crude 1%군보다 유의적으로 낮게 나타났다.
5. 간의 총 콜레스테롤 농도는 당뇨군이 정상군에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 당뇨군내에서는 각 군간에 간의 총콜레스테롤 농도가 유의적인 차이를 보여 순수분리물 0.2%군이 유의적으로 가장 낮았고 메탄올 분획물 3%군, 메탄올 분획물 1%군, 대조군의 순으로 유의적으로 낮았다. 간의 중성지방 농도는 당뇨군이 정상군에 비해 높은 경향을 보였다. 당뇨군내에서는 메탄올 분획물 1%군, 메탄올 분획물 3%군, 순수분리물 0.2 %군이 대조군보다 유의적으로 낮았다.
6. 간조직의 SOD 활성은 정상군보다 당뇨군이 낮았고 당뇨군내에서는 대조군과 메탄올 분획물 1%군보다 메탄올 분획물 3%군과 순수분리물 0.2%군이 유의적으로 높았다. Glutathione peroxidase는 당뇨군내에서 메탄올 분획물 3%군과 순수분리물 0.2%군이 대조군과 메탄올 분획물 1%군보다 유의적으로 높았다. Catalase 활성도는 정상군과 당뇨군 간에 유의적인 차이가 없었고 정상군과 당뇨군내에서도 식이에 따른 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다.
7. C-protein은 정상군보다 당뇨군이 유의적으로 높았고 당뇨군내에서도 대조군, 메탄올 분획물 1%군, 메탄올 분획물 3 %군, 순수분리물 0.2%군의 순으로 감소하여 유의적인 차이를 보였으며 순수분리물 0.2%군이 유의적으로 낮은 값을 보였다. M-protein은 당뇨군내에서 대조군, 메탄올 분획물 1%, 메탄올 분획물 3%, 순수분리물 0.2%순으로 증가하여 각 군간에 유의적인 차이를 보였고, 순수분리물 0.2%군이 가장 높게 나타났다.
8. 혈장 유리 아미노산 농도는 asprtic acid, taurine, threonine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, histidine, arginine의 농도는 정상쥐와 당뇨쥐간에 유의적인 차이가 없었고 미생물 복합발효 배양물의 섭취 정도에 따라서도 유의적인 차이가 없었다. 당뇨군내에서 glutamic acid, proline, glycine, methionine, ammonia 농도는 유의적인 차이가 없었다. 당뇨군내에서 alanine, tyrosine, lysine 농도는 crude 1%군이 대조군에 비해 유의적으로 낮았고 메탄올 분획물 1%와 메탄올 분획물 3%군간에는 유의적인 차이가 없었다.
이상에서 당뇨유발 수컷 쥐를 대상으로 미생물 복합발효 배양물 메탄올 분획물 1%, 메탄올 분획물 3%, 순수분리물 0.2%를 4주간 공급한 결과, 당뇨군내에서 메탄올 분획물 3%와 0.2% 순수 분리물이 공복시 혈당이 낮았다. 또한 당뇨쥐에서 메탄올 분획물 3%와 순수분리물 0.2%는 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방 및 LDL-콜레스테롤 농도를 유의적으로 낮추어 당뇨상태에서 혈중 지질농도를 개선하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 당뇨쥐의 간 조직 총콜레스테롤 농도는 순수분리물 0.2%가 유의적으로 가장 낮았고 간 조직의 중성지방 농도는 메탄올 분획물 1%, 메탄올 분획물 3%, 순수분리물 0.2 % 모두 대조군보다 유의적으로 낮추어 미생물 복합발효배양물의 섭취가 효과가 있었다. 당뇨쥐의 항산화효소 활성을 분석한 결과, 간 조직의 superoxide dismutase(SOD) 및 glutathione peroxidase(GSH-Px) 활성은 메탄올 분획물 3%와 순수분리물 0.2%가 대조군 보다 유의적으로 높았다.
결론적으로 미생물 복합발효 배양물 메탄올 분획물 3%와 순수분리물 0.2% 첨가 식이는 당뇨쥐에서 혈중 지질농도 개선 효과와 항산화 효소의 활성을 증가시켜 항산화작용에 유리한 것으로 사료되어진다.

Abstract ▼

On the 1st project : Production characteristics on antioxidative physiological-activated compound in complex strains culture broth Human body has various anti-oxidant system helping remove free radicals and oxygen free radicals, which lead to homeostasis maintained. That is, catalase, superoxide dis

On the 1st project : Production characteristics on antioxidative physiological-activated compound in complex strains culture broth Human body has various anti-oxidant system helping remove free radicals and oxygen free radicals, which lead to homeostasis maintained. That is, catalase, superoxide dismutase(SOD), glutathion peroxidase(GSH-Px), glutathione reductase, glutathione-s-transferase(GST) are known as antioxidative enzyme system within human body.
As enzymatic antioxidant is not enough to effectively prevent free radicals from being induced within human body, the giving of non enzymatic antioxidant should be involved to improve free radical scavenger activity.
Synthetic antioxidant is cheap and effective, so it has usually been used for the purpose of food processing, medicine and cosmetics. However, the problem of safety is sparking public rejection more and more over time.
Despite the well-known efficacy of natural antioxidant, most of them are meaningless because of the lack of necessary studies on its industrial applications. Cost competitiveness from cost reduction should be considered above all through conducting studies on high extraction yield and the simplification of purification.
These days, the recent rise in chronic and adult diseases is driving the disease prevention and the delay of aging to attraction more attention. While those who already have a disease suffer from side effects of drug consumption, healthy people have much attention on the studies of functional food to keep their health. Fermented process usually involves the production of healthy elements ; Microorganism fermentation cultures of grains or vegetable is known to have various vitamins and antioxidant. But complex microorganism fermentation culture is assumed to show a rise in various biologically active materials, not yet demonstrated due to the lack of studies on the effect and produced materials from the complex fermentation culture. Therefore, it would be significantly meaningful to find out the effect on the biological activity or the consumption consequence by each level of complex microorganism fermentation culture broth that is presumed to have an antioxidative function.
This study aimed to produce metabolic materials with a strong level of antioxidant activity through complex fermentation culture of various microorganism isolated from Korean traditional fermented foods, make possible the mass production of antioxidants using a fermentation method less affected by raw material supply or weather, and then finally develop non-toxic material proved functionally effective with potential applications, which can be seen as a basic foundation for future product development and industrialization. To study the production characteristics of antioxidant with the complex microorganism fermentation, Strain with excellent antioxidative activity in fermented food was isolated into the final four strains. Complex fermentation culture, a mixture of different types of mixed strains and Bacillus B6, Acetobacter A6, Saccharomyces S1 showed higher antioxidative activity. As a studying result of culture broth composition by these strains, the added culture of 2% in molasess, 0.5 °brix in rice extracts and 5% in rice bran extract was one of the most excellent antioxidative activity.
To set up an effective fermentation condition of antioxidative activity, the fermentation characteristics on total phenol content and electronic donating ability of each fermented broth and culture condition was researched. Then, the optimal condition of fermented broth was estimated through superimposing the response surface of each value. As a result, the most suitable range for the fermented both total phenol content and electronic donating ability was 1.8-2.2% in molasess added amount, 2.1-2.4% in rice extracts added amount and 1.9-2.4% in defatted soybean cake, and the optimum fermentation condition range was 25-35℃ in fermentation temperature, 10-14 days in fermentation time, and pH 5.5-7.5. In all, the most optimized fermentation condition is 30℃ in fermentation temperature, 12 days in fermentation time, and pH 6.5. The study on antioxidative features of solvent extracts from cultures indicated that methnoal fraction was the highest as 117.50mg% in total phenol content.
The nitrite-scavenging ability showed the highest in methnol fraction and n-butanol fraction as 94.81% and 92.61% respectively. The electronic donating ability of cultures by the DPPH and DMPD method showed the highest as 96.53%, and 73.07% respectively in methanol fraction. Fermented broth extract, neutral phenolic compound and acidic phenolic compound were fractionated and then, as a result of the analysis by C18 reverse phase HPLC and TLC, phenolic acid was extracted from neutral fraction, and major phenolic compound was showed as ferulic acid and sinapic acid.
Total phenolic compound, nitrite scavenging ability and electronic donating ability of acidic fraction and neutral fraction extracted from culture broth was measured, Total phenolic compound was the highest with 141.75mg% in neutral fraction. Nitrite scavenging ability was 98.29% and 89.29% respectively. As for the DPPH method, electronic donating ability showed stronger activity of 97.70% in neutral fraction. At the same time, the DMPD method was the same. Electronic donating ability in neutral fraction of fermented broth was far more effective than acidic fraction in antioxidative activity.
The antioxidative activity result of fraction dialysate and DEAE-cellulose column fraction among water-soluble browning material from fermentation culture showed that antioxidative ability of fraction diffusate and DEAE-cellulos column fraction was more active than fraction dialysate. Fraction diffusate was significantly high with 92.25% of scavenging ability and 289.50mg% of total penolic compound. In 0.01M acetate buffer of column fraction, electronic donating ability (DPPH radical scavenging ability) showed high activity of 81.32%. Also, from the 0.01M acetate buffer fraction, water-soluble browning material with antioxidative ability was shown to be separated.
Fraction dialysate and fraction diffusate of water-soluble browning material were fractionated by DEAE-cellulose column, and then each fractionates was spoted on TLC. As the result, presented that the two parts of Rf 0.2 and 0.35 were separated from 0.02 M HCl fraction in fraction dialysates, and Rf 0.28 and 0.45 from 0.01M AcOH fluid fraction in fraction diffusates.
As a result of the antioxidative activity comparison among the final nine kinds of mutated strain, as for the M1 mutated strain in electronic donating ability (DPPH, DMPD and ABTS radical scavenging ability), all of the antioxidative activities was shown higher than parent strain. So, targeting parent strain and mutated strain of M1, primer was manufactured, and then cloning of gene was practiced that is used to synthesize antioxidative materials.
In the test of growth inhibition effect of cancer cell lines through SRB assay, ether fraction, chloroform fraction and ethylacetate fraction in the six kinds of fermentation broth extract were inhibited the cancer cell growth in the
concentrate-dependent, as compared to the control group. The test of cancer cell growth inhibition effect among ether fraction, chloroform fraction and ethylacetate fraction through the trypan blue exclusion assay presented that higher concentration test solution means higher number of dead cells, and the number of remained cells was reduced compared with the control group. IC50 value of test solution, ether fraction, chloroform fraction and ethylacetate fraction was 0.84±0.079, 0.94±0.017 and 0.8±0.03 respectively.
On the 2nd project : Skin acceptability and development of cosmetic product using the complex strain culture broth The observation of cytotoxicity against human body, the first test of skin irritation and skin sensitizing test showed that cytotoxicity of complex fermentation culture of microorganism was 2000 times lower than SLS. In a skin sensitizing test, allergy response was almost impossible with the lower than 3 SI level. In addition, the human patch test conducted following the CTFA guideline indicated that complex fermentation culture of 5%(v/v) microorganism was safe for human body application.
The observed effect of dead skin removal showed that complex fermentation culture of microorganism was effective as much as 32.1%. In a skin moisture test, it showed as similar moisturizing power as glycerin, 1,3-butylene glycol, propylene glycol that is mostly used as a moisturizer for cosmetics.
As a comparison result with pre-culture test solution about the effect of skin lifting like free radical scavenging activity, cell activity, collagen synthesis, elastase activity inhibitory effect and MMP-1 expression inhibitory effect, the antioxidative process of complex fermentation culture of microorganism helped make the free radical scavenging activity almost nine times excellent, cell activity some twelve times, and collagen synthesis about six times.
From the result of tryosinase activity inhibition, complex fermentation culture of microorganism reduced some 68% of tyrosinase activity and was effective as much as 66.9% of L-DOPA lipid autoxidation. Also, that was helpful to inhibit melanin production as much as 69.3% within B-16 melanoma. The result from test objects who were induced to have artificial pigmentation showed the meaningful effect in tryosinase activity inhibition(p<0.05).
Through observing via optical microscope the liquid crystal structure and microcapsule structure manufactured with 1% complex culture broth, the structure was observed to be completed. In addition, as for the liquid crystal structure, physical properties were pH 6.73±0.08 with the temperature of 25℃ and viscosity was 7,530±460cP, while microcapsule structure showed pH 6.56±0.12 and 19,650±500cP in viscosity. These values are similar to physical properties of general cosmetics. The physical property change observed for 30 days showed that temperature (0℃ , 25℃ , 40℃ ) didn't play a role in changing pH and viscosity, which means its structural stability is excellent. In addition, both general test and intensive test presented its stability with the levels of formation separation, discoloration and smell change kept as before.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 15
• 목차 ... 29
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 33
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 37
• 제 1 절 국외 관련기술의 연구동향 ... 38
• 제 2 절 국내의 특허현황 ... 38
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 41
• 제 1 절 균주별 발효배양물의 항산화능 검정 ... 41
• 1. 연구수행 방법 ... 41
• 가. 항산화능 측정 ... 41
• 나. 돌연변이 선발 ... 42
• 2. 연구수행 내용 및 결과 ... 42
• 가. 항산화 활성물질 생성 균주 분리 ... 42
• 나. 선별균주 배양액의 항산화 활성 ... 43
• 다. 단일균주 및 혼합균주 배양액의 항산화 활성비교 ... 46
• 라. 탄소원의 종류 및 농도 결정 ... 49
• 마. 쌀추출물의 농도에 따른 발효액의 항산화 활성 ... 50
• 바. 부원료 첨가에 따른 발효액의 항산화 활성 ... 51
• 사. 항산화 물질분비 유전자선발을 위한 돌연변이 분리 ... 52
• 3. 결론 ... 53
• 제 2 절 발효배양액의 용매추출, 분리와 항산화 유효성 실증실험 ... 54
• 1. 연구수행방법 ... 54
• 가. 발효조건의 설정 ... 54
• 나. 항산화적 특성 시험 ... 55
• 다. 항산화 물질 분리 ... 56
• 라. UV 조사에 의한 돌연변이 유발 및 돌연변이 균주의 항산화 특성 ... 60
• 2. 연구수행 내용 및 결과 ... 60
• 가. 발효조건 설정 ... 60
• 나. 용매 분획별 항산화적 특성 ... 80
• 다. 페놀물질 분획의 성분분석과 항산화 작용 특성 ... 81
• 라. TLC 및 투석을 이용한 항산화성 수용성 갈변물질 분리 ... 84
• 마. 기존의 상업용 항산화 물질의 항산화 특성 ... 89
• 바. 돌연변이 및 돌연변이 균주의 항산화 특성 ... 90
• 3. 결론 ... 92
• 제 3 절 발효배양물의 항암 효과 및 유전자 cloning 연구 ... 94
• 1. 연구수행 방법 ... 94
• 가. SRB assay 세포 배양 ... 94
• 나. SRB assay ... 94
• 다. Trypan blue exclusion assay ... 94
• 라. 통계처리 ... 95
• 2. 연구수행 내용 및 결과 ... 96
• 가. 항암효과 ... 96
• 나. 유전자 cloning ... 100
• 제 4 절 미생물 복합 발효 배양액의 피부 안전성 및 유효성에 대한 평가 연구 ... 104
• 1. 연구수행방법 ... 104
• 가. 피부에 대한 안전성 평가 ... 104
• 나. 피부 각질제거 평가 ... 105
• 다. 피부보습효과 평가 ... 106
• 라. 항산화 작용에 의한 피부 주름개선 및 완화 평가 ... 108
• 마. 피부 미백효과 평가 ... 111
• 2. 연구수행 내용 및 결과 ... 115
• 가. 피부에 대한 안전성 평가 ... 115
• 나. 피부 각질제거 및 보습력 평가 ... 116
• 다. 항산화 작용에 의한 피부 주름개선 및 완화 평가 ... 121
• 라. 피부 미백효과 평가 ... 126
• 3. 결론 ... 129
• 제 5 절 복합발효배양액을 이용한 화장품의 제형화 및 안정성에 대한 평가 연구 ... 131
• 1. 연구수행방법 ... 131
• 가. 화장품 제형화 기술 ... 131
• 나. 제형의 안정성 평가 ... 132
• 2. 연구수행 내용 및 결과 ... 133
• 가. 화장품 제형화 기술 ... 133
• 나. 제형의 안정성 평가 ... 136
• 다. 시제품화 ... 139
• 3. 결론 ... 140
• 제 6 절 발효배양물 농도에 따른 흰쥐의 지방대사, 항산화능 활성검토 ... 141
• 1. 실험목적 ... 141
• 2. 연구수행 방법 ... 141
• 가. 실험동물 및 실험식이 ... 141
• 나. 시료분석 ... 143
• 다. 통계분석 ... 146
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 147
• 가. 체중의 변화 및 식이섭취량 측정 ... 147
• 나. 혈중 지질 분석 결과 ... 149
• 다. 간 지질 분석 결과 ... 151
• 라. 간 조직의 항산화 효소계의 활성도 ... 152
• 마. 혈액과 간 조직의 지질과산화물 ... 153
• 4. 결론 ... 155
• 제 7 절 발효배양물의 항당뇨 활성 및 항산화 효소 검토 ... 157
• 1. 실험 목적 ... 157
• 2. 연구수행방법 ... 158
• 가. 실험동물 및 실험식이 ... 158
• 나. 시료분석 ... 161
• 다. 통계분석 ... 166
• 3. 연구수행내용 및 결과 ... 166
• 가. 체중의 변화 및 식이섭취량 측정 ... 166
• 나. 혈당 변화에 미치는 영향 ... 169
• 다. 혈중 지질에 미치는 영향 ... 170
• 라. 간 지질 분석 결과 ... 173
• 마. 간 조직의 항산화 효소계의 활성도 ... 174
• 바. 혈중 인슐린 농도에 미치는 영향 ... 177
• 사. 혈액 중 유리 아미노산 농도 분석 ... 177
• 4. 결론 ... 179
• 제 8 절 분리화합물의 항산화 및 항당뇨능의 검토 ... 182
• 1. 실험목적 ... 182
• 2. 연구수행방법 ... 182
• 가. 실험동물 및 실험식이 ... 182
• 나. 시료분석 ... 186
• 다. 통계분석 ... 191
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 191
• 가. 체중 증가량 및 간무게 ... 191
• 나. 식이섭취량과 식이효율 ... 192
• 다. 혈당에 미치는 영향 ... 193
• 라. 공복시 혈당과 인슐린 농도에 미치는 영향 ... 194
• 마. 혈중 지질농도 ... 195
• 바. 간지질 농도 ... 197
• 사. 간 조직의 항산화 효소 활성 ... 198
• 아. C-protein과 M-protein 농도 ... 200
• 자. 혈장 유리 아미노산 농도 ... 201
• 4. 결론 ... 203
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 206
• 제 1세부과제 : 미생물 발효 배양에 의한 항산화성 생리활성물질의 생산 특성 ... 206
• 제 2세부과제 : 미생물 발효 배양물의 피부 적용성과 화장품 제품개발 ... 209
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 215
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 217
• 제 7 장 참고문헌 ... 218
• 끝페이지 ... 230