초록 ▼

○ 연구결과
감귤 궤양병을 일으키는 Xanthomonas axonopodis pv. citri (syn. X. citripv. citri, X. campestris pv. citri, X. smithii subsp. citri)를 분리하기 위하여 제주 16지역의 감귤원에서 채집한 감귤 잎의병징에서 36개의 세균을 분리하였다. 총 105개의 감귤 잎을 침지 접종하고, 6단계의 온도 처리를 하였으며, 감귤 잎에서의 생균수를 측정하기 위해 생균수 계수법을 사용하였다. 또한, 방제수단을 투입할 적절한 시기의 결정에 이용하기 위해 병원

○ 연구결과
감귤 궤양병을 일으키는 Xanthomonas axonopodis pv. citri (syn. X. citripv. citri, X. campestris pv. citri, X. smithii subsp. citri)를 분리하기 위하여 제주 16지역의 감귤원에서 채집한 감귤 잎의병징에서 36개의 세균을 분리하였다. 총 105개의 감귤 잎을 침지 접종하고, 6단계의 온도 처리를 하였으며, 감귤 잎에서의 생균수를 측정하기 위해 생균수 계수법을 사용하였다. 또한, 방제수단을 투입할 적절한 시기의 결정에 이용하기 위해 병원균의 배수기와 온도를 바탕으로 한 회귀식인 감염 위험도 모형을 개발하였다. 일정한 온도, 영양분 및 습윤한 조건에서 이분법에 의해 개체군의 크기가 이상적으로 증가한다고 가정하는 지수생장모형(exponential growth model)을 이용하여 궤양병균 개체군의 생장을 모사하였다.
온도가 가변적인 포장 상태에서 영양분 및 수분 등의 조건이 충분하게 주어진다고 가정하고, 궤양병균 개체군의 크기를 모사하기 위하여, 모형을 이전 시간의 개체군 크기를 이용하여 현재 시간의 개체군의 크기를 계산할 수 있는 형태로 바꾸었다. 실제 포장에서는 수분 조건 또한 가변적이므로, 엽면습윤시간 을 이용한 형태의 모형으로 수정하였다. 지속적으로 건조한 조건이 유지되면 개체군이 사멸하거나 생리적인 활성이 매우 떨어지므로, 이 효과를 적용하기 위해 개체군의 초기 크기를 1로 설정하였다. 병원균이 감염된 후 잎에 병징이 나타나기까지의 잠복기간이 문헌에 나타난 연구결과에 따르면 20-30일 정도 걸린다. 따라서 모형에 의하여 추정된 개체군 크기값으로부터 일별로 30-20일 전기간 동안의 개체군 크기값의 이동합(Moving sum of daily population size)을 구하여 이 이동합의 제곱 근 값을 병원균의 일일 감염위험도(Daily Infection Risk)로 간주하였다.
감귤 궤양병 예찰 모형의 평가를 위해 과수원 3곳에 무인기상관측기(CR10X, 캠벨사)를 설치하였고, 기존에 난지농업연구소에서 설치한 13지역의 군락기상자료 자동수집체계를 구현하였다. 제주도 감귤재배 전 지역의 예찰정보를 생성하기 위해서 기상청에서 관리하고 있는 무인기상기 22개를 이용하여 보간 방법에 의해 120m x 120m 격자 규모의 병 예찰에 필요한 기상자료를 추출하였다. 이렇게 추출된 기상자료를 바탕으로 감귤 궤양병 예찰 모형을 구동하고 지도기반의 서비스가 가능한 시스템을 구현하였다. 본 위탁과제에서는 감귤과원의 환경계측 시스템과 함께 기상청에서 제공하는 표준기상관측자료를 활용한 웹 기반의 감귤 궤양병 예찰 정보 시스템을 구현하였다. 실제 영농현장에서 활용하기 위해서는 서비스를 지속적으로 운영, 유지할 수 있는 기관으로의 이전이 필요하다.
감귤 궤양병 진전에 있어서 초미세구조적 측면을 투과전자현미경을 통하여 감수성종인 Mexican lime (Citrus aurantifoli) 과 저항성종인 Yuzu (Citrus junos)를 비교하였다. 멕시칸 라임에서 세균의 침입은 일반적으로 기주 세포벽 변형과 세포 파괴를 동반하였으며 세포벽 분해로 인하여 나타나는 fibrillar materials 는 세포간극에서 흔히 발견되었다. 괴저된 세포질로 이루어진 손상된 기주 세포들은 침입하는 세균에 인접한 세포벽으로부터 원형질막의 군집된 분리를 보여주었다. 궤양은 과도한 세포 분열로 인한 기주 세포 수의 증가로 인하여 잎의 뒷면에서 진전되는 것을 보여주었고 세균 증식과 electron-transparent capsule-like structures로 둘러싸인 세균들을 일반적으로 볼 수 있었다. Mexican lime 의 기주 세포벽 바깥쪽에서는, 다른 전자밀도를 가진 추가된 층이 세균 세포들 근처에서 뚜렷이 보였으며, Mexican lime 과 Yuzu 둘 다를 침입하는 세균 세포들 안쪽에 봉입체들이 발견되었다. 유자 잎의 경우에는, 세포벽 돌기들이 침입하는 세균과 인접한 기주 세포벽 바깥쪽에 종종 형성이 되었고 인접한 두 기주 세포들로부터 비롯된 두 개 또는 그 이상의 개별 세포벽 돌기의 융합으로 인하여 세포간극 맞물림이(교합) 형성되었다. Papilla-like materials 는 세균에 근접하여 기주 세포 안쪽에 국부적으로 축적되었다. 몇 세균들은 xylem fiber cell에서 퇴화되어가는 것을 발견하였고, 쪼그라들고 비활동적인 세균들은 세포간극에서 electron-transparent fibrillar materials 에 의해 둘러싸여져 있었는데 이것은 세균의 고정화를 의미한다. 이와는 대조적으로, 감수성인 Mexican lime의 병든 조직의 세포간극은 온전하거나 증식된 세균들을 포함하고 있었다. 이 초미세구조적 실험 결과를 가지고 모델링에 적용을 할 수는 없었지만 이 실험을 토대로 감수성과 저항성 품종 간의 defense mechanism에 대한 이해를 넓혔으면 한다. 2005년부터 2007년까지 3년간 제주도 감귤 재배지의 64개 조사 포장에서의 감귤 궤양병 발병을 조사하여 본 결과 전체적으로 잎의 경우 0.6~2.9% 발병하였으며 열매의 경우 0.2~1.0%정도 감염된 것으로 조사되었다.
2007년도 궤양병에 매우 감수성이 높은 하귤과 자몽 잎에서의 병진전 상황을 조사해 본 결과 6월 중순경에 첫 병징이 나타나기 시작하여 7월 중순경까지 급격히 병이 진전되었다. 열매의 경우 7월 24일 이전에 병이 발생하기 시작하여 9월 초순경에 급격히 증가하였다. 제주도내에 있는 대부분의 스트렙토마이신 저항성 감귤궤양병균들은 플라즈미드상의 str 유전자와 염색체 DNA상의 rpsL 유전자의 41번째 아미노산 염기서열이 AAG(lys)에서 AGG(arg)으로 돌연변이 되어 스트렙토마이신 저항성을 표현하는 것으로 추정된다. 또한 실내 실험에서 스트렙토마이신 감수성인 남군 87-27균주는 스트렙토마이신 저항성균주인 남군82-54균주와 혼합 배양을 통하여 3.3:1의 비율로 스트렙토마이신 저항성 균주로 전환되었음을 알 수 있었다. 감귤 궤양병을 방제하기 위한 자재로는 구리제가 가장 효과가 있었으나 구리제 살포 피해가 있어서 큰 문제가 되었다. 구리제 살포 피해는 고온기에 가장 심하였으며 기계유유제나 식물성 파라핀유를 혼합하여 살포하여 주면 그 피해를 경감시킬 수 있었다. 본 연구에서 개발된 감귤 궤양병 발생 예찰 프로그램을 통하여 방제시기를 결정하여 레몬 재배 농가에 방제를 실시한 결과 방제 횟수를 6회에서 5회로 경감시킬 수 있었지만 온주밀감에 적용시키기 위해서는 2회 내지 3회의 방제 프로그램 작성이 필요할 것으로 여겨진다.
감귤류에 궤양병을 일으키는 병원균을 수집 분리한 후 외국에서 도입한 대조균주와 병원형을 비교분석 하였다. 국내에서 분리한 감귤궤양병균은 자몽, 레몬, 스위트오렌지 및 온주밀감에 전형적인 궤양을 형성하며 병을 일으켜 X. axonopodis pv. citri A 형으로 판단되었다. ERIC과 BOX 및 REP PCR후 이들의 결과를 동시에 중첩분석한 결과 X. a. pv. citrumelo만을 포함하는 한 그룹과 X. a. pv. citri와 X. a. pv. aurantifolii를 포함하는 또 다른 그룹으로 구분이 가능하였는데, 두 번째 그룹에서는 X. a. pv. citri Asiatic type과 X. a. pv. aurantifolii B, C type간에 확연히 구분이 가능하였다. 16S rDNA의 시컨스를 통하여 중첩분석을 실시한 결과 X. a. pv. aurantifolii B와 C type 및 X. a. pv. citrumelo는 99%의 유사도를 보이며 동일한 그룹을 형성하였다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 국내에 발생하는 궤양병균은 모두 X. a. pv. citri A type인 것으로 생각된다. 탄소원 이용정도 및 지방산 조성에 따라서도 궤양병균의 병원형간 구분이 가능하였는데, 이들 중 몇 가지는 병원형을 구분하는데 중요한 요소로 이용될 수 있었으며, 95개의 탄소원 이용 정도에 따라 중첩분석을 한 결과 X. a. pv. citri A, A^* 및 A^w 형은 다른 병원형과 분명히 구분되었다. 병원균의 신속한 분류 동정은 검역에 있어 매우 중요한데, 병징의 확인 후 병원균의 동정까지 걸리는 시간을 절약하고, 신속 정확하게 병원형을 구분할 수 있는 방법을 개발하기 위해 다중 PCR법을 개발하였는데, 궤양병균의 병원형 검출을 위한 적정 신장온도는 60℃였다. 또한 기존에 보고된 바가 없는 X. a. pv. citri A^*과 A^w type 및 X. a. pv. aurantifolii B와 C type을 PCR을 통해 특이적으로 검출하기 위한 프라이머를 개발하였는데, 이는 향후 관련 병원형 검출에 긴요하게 사용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼

This research was conducted for three years by three teams. The contents and scopes of research by each team were as followings:
1. The project led by Eun Woo Park in Seoul National University:
① Influence of environmental factor to pathogen survival and growth on the surface of citrus leaf

This research was conducted for three years by three teams. The contents and scopes of research by each team were as followings:
1. The project led by Eun Woo Park in Seoul National University:
① Influence of environmental factor to pathogen survival and growth on the surface of citrus leaf
② Development of disease forecast model for citrus canker based on weather data
③ Ultrastructural study on responses of susceptible and resistant species of Citrus to infection by Xanthomonas smithii pv. citri
2. The project led by Yong Kyu Han in Epinet Co.
① Development of weather data acquisition system using automated weather stations
② Development of agricultural weather data management system generating near real-time data at high spatial resolution
③ Development of disease forecasting system for citrus canker at farm-based scale
3. Project led by Jae Wook Hyun in National Institute of Subtropical Agriculture
① Understand of mechanisms of streptomycin resistance of citrus canker pathogen(Xanthomonas smithii subsp. citri) in Jeju Island
② Diminishment method of copper spray injury and the mechanism
③ Development environmentally-friend control system of citrus canker disease
4. Project led by Yong Hoon Lee in National Institute of Agricultural Science and Technology
① Diversity of Xanthomonas smithii pv. citri by host range and physiochemical characteristics
② Genetic diversity of Xanthomonas smithii pv. citri strains
③ Analysis of diversity in pthA gene and virulence of Xanthomonas smithii pv. citri
④ Development of multiplex PCR methods for differentiation of pathotypes
⑤ Design of specific primers for pathotype detection

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• 목차 ... 19
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 24
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 24
• 제 2 절 연구범위 ... 26
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 27
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 29
• 제 1 절 감귤 궤양병 발생 생태 규명 및 예찰모형 개발 ... 29
• 1. 감귤 잎 표면에서의 병원균의 분리 및 동정 ... 29
• 가. 재료 및 방법 ... 29
• 1) 궤양병균 분리 및 동정 ... 29
• 2) Tn5를 이용한 GFP-tagged mutant 선발 ... 29
• 3) 자연돌연변이(spontaneous mutation)를 통한 rifampicin 저항성 mutant 선발 ... 29
• 나. 결과 및 고찰 ... 30
• 1) 균주 동정 및 병원성 시험 ... 30
• 2) GFP-tagged mutant의 growth rate 차이 ... 31
• 3) Rifampicin 저항성 mutant의 growth rate 차이 ... 33
• 2. 감귤 잎 표면에서의 병원균의 생존과 생장에 미치는 환경 요인의 영향 규명 ... 34
• 가. 재료 및 방법 ... 34
• 1) 잎 표면에서 온도에 따른 병원균의 doubling time 측정 ... 34
• 나. 결과 및 고찰 ... 35
• 1) Doubling time 모형 개발 ... 35
• 3. 월동 후 감귤 잎 발육에 따른 잎 표면의 미세구조 변화 연구 ... 37
• 가. 재료 및 방법 ... 37
• 1) 감귤잎 발육 단계 측정 및 샘플 채취 ... 37
• 2) 현미경 관찰을 위한 샘플 채취 및 방법 ... 37
• 나. 결과 및 고찰 ... 37
• 1) Leaf size ... 37
• 2) 감귤 잎의 미세구조 변화 ... 38
• 3) 큐티클 층 두께 측정 ... 39
• 4) 기공 수 측정 ... 41
• 4. 병원균 접종 후 감수성과 저항성 종에 따른 잎의 초미세 구조적 반응 연구 ... 42
• 가. 재료 및 방법 ... 42
• 나. 결과 및 고찰 ... 43
• 1) 궤양 병반 모습 ... 43
• 2) 접종 시 Mexican lime 과 Yuzu 잎의 초미세 구조적 차이 ... 44
• 5. 감귤원에서의 궤양병 발생 역학조사 ... 48
• 6. 실시간 기상자료를 이용한 감귤 궤양병 발생 예찰 모형 개발 ... 49
• 가. 지수생장모형에 기초한 감염 위험도 모형 개발 ... 49
• 나. 모형의 평가 ... 50
• 제 2 절 감귤 궤양병 발생 예측 정보제공 시스템 구현 ... 54
• 1. 군락기상 관측 및 자료 수집체계 구축 ... 54
• 가. 재료 및 방법 ... 54
• 1) 무인 기상관측기 설치 및 군락기상관측 ... 54
• 2) 군락기상자료 자동수집체계 ... 56
• 나. 결과 및 고찰 ... 56
• 1) 군락기상 관측 수집체계 ... 56
• 2) 군락기상자료 열람체계 ... 58
• 2. 제주도 전역 준 실시간 그물망 농업 기상 추정 및 관리체계 구축 ... 60
• 가. 재료 및 방법 ... 60
• 1) 기상청 표준기상관측자료 자동 수집체계 개발 ... 60
• 2) GIS 기술을 이용한 기상보간자료 생산 ... 60
• 나. 결과 및 고찰 ... 61
• 1) 무인기상관측자료를 활용한 보간기상 추정 ... 61
• 3. 감귤 궤양병 발생예측 서비스 시스템 구축 ... 63
• 가. 재료 및 방법 ... 63
• 1) 감귤 병해충 조사정보 수집 관리 및 커뮤니티 시스템 구축 ... 63
• 2) 국지 감귤 궤양병 발생 예측 정보 서비스 시스템 구축 ... 63
• 나. 결과 및 고찰 ... 63
• 1) 조사정보수집 관리 및 회원 각 정보교환 ... 63
• 2) 국지 감귤 궤양병 예측 정보 서비스 시스템 구축 및 운영 ... 65
• 제 3 절 감귤궤양병균의 항생제 저항성 생태 규명 및 환경친화적 방제체계 개발 ... 68
• 1. 감귤 궤양병 발병 현황 ... 68
• 2. 감귤 궤양병의 진전 상황 ... 69
• 3. 항생제 저항성균의 생태 연구 ... 70
• 3-1. 항생제 저항성 균의 분포정도 및 교차저항성 ... 70
• 가. 재료 및 방법 ... 70
• 나. 결과 및 고찰 ... 70
• 3-2. 저항성 형질 획득 기작 ... 72
• 가. 재료 및 방법 ... 72
• 1) Str 유전자 확인 ... 72
• 2) rpsL 유전자 상의 point mutation 확인 ... 73
• 3) 감귤 궤양병균의 스트렙토마이신 저항성 유전자 획득 및 발현 기작 ... 73
• 나. 결과 및 고찰 ... 73
• 1) Str 유전자 확인 ... 73
• 2) rpsL 유전자 상의 point mutation 확인 ... 74
• 3) 감귤 궤양병균의 스트렙토마이신 저항성 유전자 획득 및 발현 기작 ... 75
• 4. 구리피해 발생 현황 조사 ... 77
• 4-1. 구리제 종류에 따른 구리제 살포 피해 정도 ... 77
• 가. 재료 및 방법 ... 77
• 나. 결과 및 고찰 ... 78
• 4-2. 구리제와 파라핀유 혼용시 구리 피해 경감 원인 ... 80
• 가. 재료 및 방법 ... 80
• 나. 결과 및 고찰 ... 80
• 5. 친환경적 방제 체계 확립 ... 83
• 가. 재료 및 방법 ... 83
• 나. 결과 및 고찰 ... 83
• 6. 농가 실증을 통한 방제 체계 확립 ... 86
• 가. 재료 및 방법 ... 86
• 나. 결과 및 고찰 ... 86
• 제 4 절 국내 감귤류 궤양병균의 병원유전학적 특성 규명 ... 88
• 1. 감귤궤양병균의 기주범위 및 생리 화학적 특성에 의한 다양성 분석 ... 88
• 가. 재료 및 방법 ... 88
• 1) 감귤류 궤양병균 분리 및 동정 ... 88
• 2) 기주범위조사 ... 90
• 3) 탄소원 이용정도 분석 ... 90
• 4) 지방산조성 분석 ... 90
• 나. 결과 및 고찰 ... 90
• 1) 균주 동정 및 병원성 시험 ... 90
• 2) 기주범위에 따른 병원형 판별 ... 91
• 3) 탄소원이용 정도 차이 ... 92
• 4) 지방산 조성 차이 ... 92
• 5) 탄소원 이용과 지방산 조성의 차이에 따른 중첩분석 ... 93
• 2. 분리균주의 유전적 다양성 ... 95
• 가. 재료 및 방법 ... 95
• 1) 염색체 DNA의 분리 ... 95
• 2) DNA 증폭을 위한 PCR 조건 ... 95
• 3) rep-PCR결과 분석 ... 96
• 4) 16S DNA 분석 ... 96
• 나. 결과 및 고찰 ... 97
• 1) rep-PCR에 의한 궤양병관련 Xanthomonas 균주의 유연관계 분석 ... 97
• 2) 16S rDNA 분석 ... 100
• 3. 비병원성 유전자 및 균주별 병원성의 차이 분석 ... 101
• 가. 재료 및 방법 ... 101
• 1) 병원력 검정 ... 101
• 2) Southern hybridization ... 101
• 3) Plasmid 분리 ... 102
• 나. 결과 및 고찰 ... 102
• 1) 균주 및 병원형별 병원성 차이 분석 ... 102
• 2) 감귤류 궤양병균의 비병원성유전자(pthA) 분석 ... 104
• 4. 병원형 판별을 위한 Multiplex PCR법 개발 ... 107
• 가. 재료 및 방법 ... 107
• 1) 균주 및 DNA분리 ... 107
• 2) 프라이머 및 PCR 조건 ... 108
• 3) Whole cell PCR ... 109
• 나. 결과 및 고찰 ... 110
• 1) 다중 PCR을 위한 PCR 조건 및 프라이머별 특이성 ... 110
• 2) Multiplex PCR에 의한 병원형 판별 ... 111
• 3) Whole cell PCR 및 검출한계 ... 112
• 5. 병원형 검출을 위한 특이 프라이머 개발 ... 112
• 가. 재료 및 방법 ... 112
• 1) 사용 균주 및 배양조건 ... 112
• 2) 프라이머 제작 및 PCR 조건 ... 113
• 3)Whole-cell PCR 및 검출한계조사 ... 114
• 나. 결과 및 고찰 ... 114
• 1)특이프라이머를 이용한 감귤궤양병균의 검출 ... 114
• 2) 검출한계 ... 118
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 119
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 120
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 121
• 제 7 장 참고문헌 ... 121
• 끝페이지 ... 127