초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구를 통해 개발된 백신후보물질, 특히 Fc conjugated EHV-1은 일반적인 사독 백신보다 항체생성능 등의 백신효능이 매우 향상되었다. 백신개발의 기반기술인 Fc receptor를 표적화시키는 기술은 현재 학술적인 측면에서만 논의되고 있고 실제 상업용 백신을 개발한 예는 없는 실정이다. 본 연구에서 사용되었던 EHV 항원을 타 병원성 항원으로 교체할 경우 백신접종 시 면역형성이 어려운 질병에 대한 새로운 백신개발이 가능할 것으로 생각된다. 또한 본 연구에서 개발된 기초기술은

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구를 통해 개발된 백신후보물질, 특히 Fc conjugated EHV-1은 일반적인 사독 백신보다 항체생성능 등의 백신효능이 매우 향상되었다. 백신개발의 기반기술인 Fc receptor를 표적화시키는 기술은 현재 학술적인 측면에서만 논의되고 있고 실제 상업용 백신을 개발한 예는 없는 실정이다. 본 연구에서 사용되었던 EHV 항원을 타 병원성 항원으로 교체할 경우 백신접종 시 면역형성이 어려운 질병에 대한 새로운 백신개발이 가능할 것으로 생각된다. 또한 본 연구에서 개발된 기초기술은 다양하게 적용이 가능하기 때문에 한 단계 더 발전시켜 새로운 원천기술의 개발이 필요할 것으로 사료된다.

Abstract ▼

Purpose
The vaccine developed in this study is a new type vaccine that target dendritic cells, the professional antigen-presenting cells (APCs) compared to conventional vaccines. To maximize the antigen delivery, we conjugated EHV antigen to Fc part of antibody. The Fc conjugated viral antigen is

Purpose
The vaccine developed in this study is a new type vaccine that target dendritic cells, the professional antigen-presenting cells (APCs) compared to conventional vaccines. To maximize the antigen delivery, we conjugated EHV antigen to Fc part of antibody. The Fc conjugated viral antigen is expected to be efficiently processed and presented after the entry into APCs.
In case of horse diseases, there is no available diagnostic kit, but the demand of kit should be increased as the industry related to horse is growing fast. It is thus necessary that the basis for the domestic production of diagnostic kits is established. For this, we tried to develop ELISA and Immunochromatography, a rapid diagnostic method.
Contents and scope
In this study, we established the conditions of high-titer EHV production, and performed the in vitro and in vivo experiments after the establishment of mouse model to evaluate the efficacy of vaccine candidate. A variety of experiments revealed the generation of humoral and cellular immunity with the inoculation of vaccine candidates. The optimal conditions, such as the dose, times, sampling period of vaccine candidates, were established. And EHV-specific ELISA was used to determine the antibody amount in the inoculated mice and the intracelluar IFN-gamma staining of CD4+ T cells was used to check if mice have the cytotoxic T lymphocytes, which can kill the virus infected cells. Furthermore, we compared our vaccine candidates with a commercially available EHV vaccine in the aspect of efficacy.
For the development of diagnostic reagents, the production of specific antibody as a basic material and the development of ELISA and ICG using antibody were suggested. And also, we performed the production of recombinant gD expressed in E. coli for the antibody detection.
Suggestions for the use of research products
Among our vaccine candidates, Fc conjugated EHV-1 showed the higher vaccine efficacy including the production of antibody compared to generally used vaccine using dead virus. The technology used in this study, the targeting Fc receptor, is now discussed only in research area and there is no commercially available vaccine using this technology. If EHV antigen of our vaccine candidates will be replaced by other pathogenic antigens, we expected the development of new vaccines against diseases, which host can't generate enough immunity upon infection. And also, our basic techniques should be developed into further developed techniques with originality and thus a variety of efforts are needed.

목차 Contents

• 제 출 문 ... 1
• 요 약 문 ... 2
• SUMMARY ... 4
• CONTENTS ... 6
• 목 차 ... 9
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 12
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 14
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 16
• 제1절 재료 및 방법 ... 16
• 1. EHV-Fc Fusion 백신 ... 16
• 가. 바이러스 배양 및 정제 ... 16
• 나. 바이러스 불활화 및 정제 ... 19
• 다. 말 IgG Fc분획의 정제 ... 19
• 라. EHV-Fc 단백 융합체의 제조 및 정제 ... 20
• 2. 백신 효능시험 ... 22
• 가. 수지상세포 표적화 기술개발 ... 22
• 나. 말 수지상세포 배양 및 기능 확인 ... 22
• 다. 표적화단백질 선별 ... 23
• 라. 수지상세포를 이용한 in vitro 시험법(체액성, 세포성면역) 확립 ... 24
• 마. 고효율 equine dendritic cells (DCs) 배양기술 확립 ... 25
• 바. Equine IgG-FITC에 대한 항원탐식과정 규명 ... 26
• 사. 마우스의 사용 및 관리 ... 27
• 아. EHV 백신후보물질의 접종 및 혈액채취 ... 27
• 자. EHV특이항체의 정량을 위한 ELISA (체액성면역 측정) ... 28
• 차. EHV특이세포성면역의 측정을 위한 유세포분석 (세포성면역 측정) ... 28
• 카. 기타 실험 ... 29
• 3. EHV-1, -4에 대한 진단법 ... 31
• 가. 마우스면역 ... 31
• 나. Hybridoma 작성 ... 31
• 다. Hybridoma의 screening ... 32
• 라. 단클론항체의 정제 ... 32
• 마. ELISA kit ... 32
• 바. ICG kit ... 33
• 4. 제조합 gD ... 35
• 가. Viral gpD gene 분리 ... 35
• 나. gD gene cloning ... 37
• 다. Expression of EHV-1, 4 recombinant gD ... 45
• 라. Purification of EHV-1, 4 recombinant gD ... 46
• 5. EHV-3의 발생 보고 ... 49
• 가. 환축 ... 49
• 나. 세포 및 바이러스 배양 ... 49
• 다. DNA 염기서열분석 ... 49
• 라. 전자현미경 관찰 ... 50
• 마. EHV3 항체검사를 위한 ELISA ... 50
• 제2절 결과 ... 51
• 1. EHV-Fc Fusion 백신 ... 51
• 가. 바이러스의 역가 ... 51
• 나. 바이러스 대량배양을 위한 최적 MOI ... 52
• 다. CPE별 배지와 MDBK 세포내의 virus titeration ... 55
• 라. 바이러스의 불활화 ... 56
• 마. 말 IgG Fc분획의 정제 ... 57
• 바. EHV-Fc 단백 융합체의 제조 ... 58
• 2. 백신 효능시험 ... 60
• 가. 말 수지상세포 및 T 림프구 분리, 배양 ... 60
• 나. 수지상세포 표적화 이용 가능한 단백질의 탐색 ... 63
• 다. Mannosylated-FITC-albumin 적용실험 ... 64
• 라. 수지상세포의 림프구자극능에 대한 EHV효과 ... 65
• 마. 수지상세포 표면 Fc 수용체의 탐식작용 연구 ... 68
• 바. 백신후보물질의 체액성면역 (humoral immunity) 시험결과 ... 70
• 사. 백신후보물질의 세포성면역 (cellular immunity) 시험결과 ... 73
• 아. Live or Dead EHV-1 virus를 접종한 수지상세포의 면역반응시험 ... 74
• 3. EHV에 대한 진단법 ... 78
• 가. Monoclonal Abs의 특성 ... 78
• 나. ELISA ... 79
• 다. ICG ... 81
• 4. 제조합 gD ... 83
• 가. EHV-1 gD cloning ... 83
• 나. EHV-4 gD cloning ... 88
• 다. EHV-1 및,-4 sequencing ... 93
• 5. EHV-3의 국내최초 보고 ... 97
• 가. 실험마에서의 항체수준 ... 97
• 나. EHV-3의 감염과 항체지속기간 ... 99
• 다. PCR 검사와 비교한 ELISA의 민감도 및 특이도 ... 100
• 라. EHV3 원인 바이러스 분리 및 임상소견 ... 101
• 마. 가검물의 EHV-3 PCR 분석 ... 104
• 바. 바이러스 배양 ... 105
• 사. 전자현미경 관찰 ... 106
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 107
• 제 1절 목표달성도 ... 107
• 제 2절 관련분야에의 기여도 ... 107
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 109
• 제 6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 110
• 제 7 장 참고문헌 ... 111
• 끝페이지 ... 114