선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 1), 말 생산농가에 경제적 피해를 입혔으나 다행히 원인바이러스 분리에 성공하였다. 본 논문은 EHV-3의 특성을 파악한 후 향후 기초연구에 응용하기 위하여 배양세포접종을 통한 증식여부를 관찰과 바이러스의 gG protein을 coding하는 DNA Sequencing 분석을 통한 표준주와의 상동성(homology)의 조사 및 전기영동을 통한 단백질의 특성을 조사하였다.
제안 방법
- Cell에서 분리한 EHV-3 gG의 DNA 염기서열 분석은 ABI 3730XK (Big Dye Chemistry, USA)를 이용하였으며 미국립보건원 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에 등록되어 있는 EHV-3 334/74 strain과 비교하였다.
- 4 μM의 forward primer와 reverse primer를 각각 1 μl, 5 μl DNA를 첨가하여 총용량이 50 μl가 되도록 하였다. Cycling은 GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer, USA)을 이용하여 수행하였다. Initial denaturing은 95℃ 에서 10 분간 반응시키고 denaturation은 95℃에서 1 분, annealing은 60℃에서 1 분, extension은 72℃에서 1 분씩 40 cycles 하였으며 final extension은 72℃에서 10 분간 실시하였다.
- PCR primer x (2.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM Taq polymerase, 0.5 unit, Bioneer, Korea)에 PCR grade sterile water, 0.4 μM의 forward primer와 reverse primer를 각각 1 μl, 5 μl DNA를 첨가하여 총용량이 50 μl가 되도록 하였다.
- PCR로 증폭된 products 10 μl를 TAE (0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTA, pH 8.0) buffer를 running buffer로 하는 2% agarose gel에 로딩 후 100 mV, 30 분간 mini-gel electrophoresis unit(MUPID-2)에서 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, 0.5 μg/ml)로 염색하여 UV transilluminator로 EHV-3의 gG gene에 대한 증폭산물의 크기를 관찰하였다.
- Separating gel은 Table 3과 같이 조성하여 APS와 TEMED를 혼합하고 gel plate에 분주하였다. Palte와 glass plate 사이에 기포발생 없이 분주하고 well의 끝에서 1 cm 정도의 stacking gel을 위한 공간을 남겨두고 DDW를 채워서 gel이 수평이 되게 하였다. Separating gel이 굳은 후 DDW를 제거하고 stacking gel을 Table 2와 같은 조성으로 하되 분주 전 10% APS와 TEMED를 혼합한 후 plate 상단까지 분주하고 well을 기포발생이 없도록 주의하여 comb을 삽입하였다.
- 세포를 수확하여 바이러스 DNA를 추출한 후 PCR 검사를 수행하였다. 그 결과 EHV-3에만 양성이었고 EHV-1 및 EHV-4에는 음성이었다(Fig.
- 전기영동의 조건은 100 mA/gel로 영동장치에 전원을 50 mV로 조정하고 bromphenol blue dye가 stacking gel을 벗어 날 때까지 영동하였다. 이후, 100 mV로 승압하여 약 1 시간 동안 bromphenol blue dye가 바닥에 도달할 때까지 전기영동을 실시하였다.
- 토끼 신장유래 RK-13 cell (ATCC 174)을 10% FBS, penicillin (100 IU/ml), streptomycine sulfate (100 μg/ml), amphoterin B (2.5 μg/ml), 0.1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acids, 1.5 g/l sodium bicarbonate가 첨가된 α-MEM, 플라스틱 배양병(Corning, Mexico)을 이용하여 5% CO2 분압, 37℃ 환경 하에서 배양하였다.
- 고속원심분리를 통해 얻은 침전물은 phosphate buffered saline (PBS)에 하룻밤 동안 다시 부유시키고 sucrose gradient ultra centrifuge(SGUC, 148,000× g)를 2 시간동안 실시하여 바이러스를 정제하였다. 회수된 분획은 당도계를 이용하여 당도를 확인하고 PCR을 통해 type을 확인한 후 각 실험에 사용하였다.
이론/모형
- QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 제한희석방법으로 EHV-3 DNA를 추출하였다. 감별진단을 위하여 EHV-1 및 EHV-4의 primer는 Borchers와 Slater [1]의 방법으로 제작하였고 glycoprotein B (gB)의 특이적인 nucleotide sequence를 사용하였다.
- SDA-polyacrylamide gel을 제조하기 위한 시약은 SDS-PAGE를 위해 Laemmli [14]의 방법을 이용하여 Table 2와 같이 준비하였다. Separating gel은 Table 3과 같이 조성하여 APS와 TEMED를 혼합하고 gel plate에 분주하였다.
- QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 제한희석방법으로 EHV-3 DNA를 추출하였다. 감별진단을 위하여 EHV-1 및 EHV-4의 primer는 Borchers와 Slater [1]의 방법으로 제작하였고 glycoprotein B (gB)의 특이적인 nucleotide sequence를 사용하였다. 그리고 EHV-3를 확진하기 위하여 primer는 Hartley 등[9]의 방법으로 제작하였고 glycoprotein G (gG)의 특이적인 nucleotide sequence를 사용하였다(Table 1).
- 감별진단을 위하여 EHV-1 및 EHV-4의 primer는 Borchers와 Slater [1]의 방법으로 제작하였고 glycoprotein B (gB)의 특이적인 nucleotide sequence를 사용하였다. 그리고 EHV-3를 확진하기 위하여 primer는 Hartley 등[9]의 방법으로 제작하였고 glycoprotein G (gG)의 특이적인 nucleotide sequence를 사용하였다(Table 1). PCR primer x (2.
성능/효과
- 5에 나타내었다. 400개의 염기에서 국내분리 EHV-3는 EHV-3 334/74 strain과 397개가 일치하여 99.25%의 상동성을 보였고 분리된 바이러스는 EHV-3 거로주(Georo strain)라 명명하였다.
- RK-13 cell에서 분리한 바이러스를 PCR 검사에서 확인한 결과 EHV-3만 검출되었고 EHV-1 및 EHV-4는 검출되지 않아서 말구진은 EHV-1 및 EHV-4와 무관함을 확인하였다.
- Swab에서 바이러스 DNA를 추출하여 10배씩 serial dilution을 한 후 PCR 검사를 실시한 결과 104까지 밴드를 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 25%의 상동성을 나타내어 점돌연변이가 있었음을 알 수 있었다. 그리고 단백질 분석을 위한 전기영동에서 EHV-3가 EHV-1보다 적은 수의 밴드를 나타내었고 국내 분리주 EHV-3 거로주의 단백질을 분석한 결과 145 kD, 60 kD, 45 kD 및 40 kD에서 밴드를 관찰하였다.
- 염기서열분석에서는 본 실험에서 분리한 EHV-3 거로주와 EHV-3 334/74 strain의 상동성을 확인하기 위해 DNA sequencing 한 결과 99.25%의 상동성을 나타내어 점돌연변이가 있었음을 알 수 있었다. 그리고 단백질 분석을 위한 전기영동에서 EHV-3가 EHV-1보다 적은 수의 밴드를 나타내었고 국내 분리주 EHV-3 거로주의 단백질을 분석한 결과 145 kD, 60 kD, 45 kD 및 40 kD에서 밴드를 관찰하였다.
- 위의 세포를 배양하여 계대 24시간 후에 약 80% sheet를 확인하고 변병에서 채취한 면봉을 α-MEM에 담근 후 배지 1 ml을 접종하여 세포가 변성, 탈락되는 것을 확인하였다.
- 전기영동 결과에서는 EHV-3가 EHV-1보다 적은 수의 밴드를 확인할 수 있었다(Fig. 6). 국내 분리주 EHV-3 거로주의 단백질을 분석한 결과 145 kD, 60 kD, 45 kD 및 40 kD에서 단백 밴드를 관찰하였다.
- 2에 나타내었다. 접종 48시간부터 세포변성효과가 나타남을 확인하였고 접종 72 시간부터는 세포박리가 일어남을 알 수 있었고(Fig. 2), 임상증상과 실험실검사에서 본 질병은 말구진임을 확진하였다.
후속연구
- 2011년 말산업육성법의 제정으로 인하여 국내 말산업규모가 증가하고 이와 병행하는 말생산의 위험요소도 증가할 것으로 예상된다. 그러므로 말 생산성 향상 및 말구진의 예방을 위하여서는 추후 이에 대한 연구도 필요하다고 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.