초록 ▼

○ 연구결과
본 실험실에서 전국 4개 지역 [밀양(영남농업시험장), 익산(호남 농업시험장), 청원(충북 농업기술원), 수원(농업과학기술원)] 벼 포장에서 근권 및 엽권에서 분리한 식물생장촉진 미생물을 60개를 대상으로 하여 생장 속도, 질소 고정 능을 측정하고 이 중 우수한 미생물로 판단되는 6균주를 대상으로 16S DNA sequencing을 하여 이 결과를 NCBI에 보고한 후 Accession Number를 부여 받았다. 또한 청주 지역에서 다양한 전작물을 대상으로 근권에서 분리한 Azospirillum 12종을 대상으로

○ 연구결과
본 실험실에서 전국 4개 지역 [밀양(영남농업시험장), 익산(호남 농업시험장), 청원(충북 농업기술원), 수원(농업과학기술원)] 벼 포장에서 근권 및 엽권에서 분리한 식물생장촉진 미생물을 60개를 대상으로 하여 생장 속도, 질소 고정 능을 측정하고 이 중 우수한 미생물로 판단되는 6균주를 대상으로 16S DNA sequencing을 하여 이 결과를 NCBI에 보고한 후 Accession Number를 부여 받았다. 또한 청주 지역에서 다양한 전작물을 대상으로 근권에서 분리한 Azospirillum 12종을 대상으로 2차 선발한 3종을 16S DNA sequencing을 하여 이 결과를 NCBI에 보고한 후 Accession Number를 부여 받았다.
선발균주의 IAA와 Cytokinines(iPA, t-ZR) 생산량 측정은 IAA의 경우 Azospirillum 균주가 Methylobacterium보다 IAA 생선능이 우수 하였으며 특히 Azospirillum brasilense CW 903은 IAA 생성량이 71.38ug/ml로 매우 높게 나타났다. 엽권 미생물 인 Methylobacterium균주 중에는 Methylobacterium sp. 120 및 130이 높은 IAA 생성능을 나타내었다. Cytokinines(iPA, t-ZR) 생성은 2차 선발 균주 4개 모두에서 확인되었으며 특히 CBMB20가 iPA 47ng/L, t-ZR 33ng/L의 생성능을 보여 가장 우수한 균주로 판단되었다.
식물 생장 조절물질의 생산능을 확인한 균주를 이용하여 식물생육촉진 미생물의 접종이 벼의 발아에 미치는 영향을 살펴보았다. 식물생육촉진 엽권 미생물 접종은 발아율 20%, 발아속도 10% 및 유묘의 생체량 8%의 증기를 나타내었으며 특히Methylobacterium sp. CBMB20은 국내 타 기관 보유균주(KACC 10744)와 발아에 미치는 효과가 비슷하게 나타났다. 또한 식물생육촉진 엽권 미생물의 접종은 유묘의 생육 단계별 seedling vigour index도 각 단계에서 공히 유의성 있는 증가를 나타내었다.
식물생육촉진 엽권 미생물의 접종이 벼 유묘의 t-ZR(trans-zeatin riboside), iPA(isopentenyladenosine) 및 IAA(농indole-3-acetic acid) 농도에 미치는 영향을 살펴보았다. CBMB30, Burkholderia sp. CBMB40을 접종한 결과 t-ZR은 10배, iPA는 25-225%, IAA 는 15%의 증가를 나타내었다. 반면 t-ZR(-)변이체인 M. extorquens miaA-의 접종은 벼 유묘의 t-ZR농도를 증가 시키지 못하였다. 이러한 결과는 식물생육촉진 엽권 미생물의 접종이 유묘의 식물생장조절물질의 농도를 증가시켜 발아율 및 유묘의 생체량을 증가시키는 것을 나타낸다. 또한 토마토 및 고추의 유묘 생산에 미치는 영향을 살펴본 결과 CBMB 20의 접종은 무처리에 비하여 유묘 뿌리의 길이를 토마토는 40%, 고추는 49% 증가 시켰고, CBMB 110의 접종은 무처리에 비하여 유묘 뿌리의 길이를 토마토는 61%, 고추는 66% 증가 시켰다. 반면 t-ZR(-)변이체인 M. extorquens miaA-의 접종은 무처리구보다는 유묘의 뿌리성장을 촉진하였으나 그 증가 폭은 CBMB20 및 110 접종처리에 비하여 미미하였다.
미생물의 처리 농도(4.18 × 10⁶; 4.74 × 10⁸; 1.20 × 10⁹ cfu/ml)에 따른 고추의 생장과 무기물질 함량을 측정하였다. 그 결과 미생물을 처리한 경우 고추의 줄기와 뿌리의 길이가 현저히 증가하였으며 건중량 또한 50%까지 증가하였다. 줄기의 경우 최고 24%의 길이의 증가가 측정되었으며 뿌리의 길이신장은 최고 15%의 증가가 측정되어 뿌리에 비하여 줄기의 길이 신장이 더 촉진되는 것을 알 수 있었다. 그러나 고추의 생장은 처리된 미생물의 농도에는 크게 영향을 받지 않아서 처리된 미생물의 수가 결정적이지는 않은 것을 알 수 있었다. 또한 미생물의 처리 방법에 따른 작물의 생장을 측정하였다. 처리 방법으로는 종자침윤처리, 토양처리, 식물에 분무처리 등 3가지 방법을 사용하였다. 단일 처리의 경우 옆면분무처리 (PS), 토양처리(SA), 종자침윤처리(ST)의 순으로 생장 촉진 효과가 높게 나왔으며 종자침윤처리와 , 잎에 분무처리를 병행한 처리구 (ST + PS)에서 줄기의 길이가 약 40% 정도 증가하였으며 뿌리의 길이도 약 22% 정도 증가하여 생육이 가장 많이 촉진되었다. 그리고 무기물질 함량의 경우 미생물의 처리에 의한 유의성 있는 변화는 볼 수 없었다.
식물호르몬의 측정 결과는 종자처리, 토양처리, 식물에 분무처리 각각의 경우에는 대조구와 큰 차이를 보이지 않았으나 세가지방법을 동시에 처리한 경우에는 시토키닌의 함량이 줄기와 뿌리 모두에서 100% 가량 증가함을 알 수 있었다.
gfp 형질전환 균주 M. suomiense CBMB120의 gfp 유전자 합성 및 안정성을 실험하였다. CBMB120-gfp29 균주는 UV하에서 약한형광을 띄지만 비형질전환 균주에 비해서는 쉽게 구분할 수 있었으며, CLSM하에서는 쉽게 형광을 확인 할 수 있었다. 또한 CBMB120-gfp29의 PCR수행 결과 예상했던 643 bp에서 밴드를 확인 할 수 있었으며, 형질전환 균주의 밀도를 측정한 결과는 비형질전환균주와 비슷한 범위로 나타났다. 또한 TSA, AMS 배지(0.05% succinate 와 0.05% methanol첨가)에서 배양한 CBMB120-gfp29의 형태와 성장 패턴은 비형질전환 균주와 비슷한 양상을 보였다.
균주 접종 7일과 10일후 토마토와 벼를 각각 수확하여 작물 처리 시 접종효과와 군집화능 확인하였다. CLSM 사진 분석 결과 벼에서 CBMB120-gfp29는 높은 형광을 띄었으며, 쉽게 균주 군집체를 확인 할 수 있었다. 대조군 벼의 뿌리에서는 형광을 확인 할 수 없었으며, CBMB120-gfp29을 처리한 식물의 뿌리 단면에서 단일 분포 되어 있는 장대모양의 간상균과 둥근 모양의 미생물 군칩체를 확인하였다. 또한 표피 세포층을 따라 CBMB120-gfp29 군집체들이 길게 줄지어 있는 것을 볼 수 있었으며, 표피세포의 사이 공간에 길게 존재 하고 있었다. 그러나 표면 멸균 후의 벼 뿌리 횡단면에서는 균주 군집체를 확인 할 수 없었다. 또한 근권 접종 후 다수의 단일 균주 세포들을 잎의 잎살에서 볼 수 있었으며, 기공에서도 확인 할 수 있었다. 토마토의 경우 균주 무처리군 에서는 균주 세포를 볼 수 없었고, 균주 처리군에서는 다수의 단일 균주 세포들이 뿌리 표면에서 특정 위치에 국한되지 않고 쉽게 확인 할 수 있었으며, 또한 특이적으로 뿌리의 단층면에서도 단일 균주 세포를 확인 할 수 있었다. 벼와는 다르게, 뿌리 표면을 멸균한 토마토 뿌리의 표피 세포 사이공간에서 균주 군집체를 확인 할 수 있었다. 뿌리털은 이 시기에 뿌리들에서 많이 자라지만, 토마토와 벼 뿌리털 모두에서 균주 세포를 확인 할 수 없었다. 대다수의 단일 세포와 군집체들은 토마토 잎의 잎살과 세포막 부분에서 볼 수 있었다. 또한 잎의 표피 조직에도 균주가 침투해 있었으며, 때때로 기공에서도 녹색 형광을 발현하는 균주세포를 관찰 할 수 있었다. 비록 균주 세포들이 집중되어 있지는 않지만, 단일 균주 세포의 존재는 잎 표면을 멸균한 토마토 잎의 표피세포 사이 공간에서도 확인 되었다.
또한 전자 현미경 관측으로 CBMB120가 벼와 토마토에 서식하는 패턴을 쉽게 관찰할 수 있었다. 벼에서 무처리구에서는 세균 세포가 보이질 않는다. 그에 반하여 미생물이 접종된 작물에서는 많은 개체가 발견되며 뿌리의 표면에 있는 점액질의 엽초 및 표면과 엽초의 안쪽에서 찾을 수 있다. 단일 세포들 또한 주근의 외부쪽에 전체적으로 퍼져있는 것을 확인하였다. 잎의 경우 종자를 접종한 이후 모든 부분에서 세포를 확인할 수 있었다. 무처리구에서는 잎의 표면에서 미생물이 발견되지 않았지만, 미생물을 접종한 처리구에서는 잎의 돌기부분 사이의 잎 점막층에 미생물이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 단일 균주 세포들은 잎의 표면의 모상체부분에 모여 있는 것이 발견되었다. 돌기부분에서도 균주 세포들를 확인할 수 있었는데, 이것은 현재 성장하고 있는 세포를 나타낸다 수많은 단일 또는 군집을 이루는 세포들은 . 토마토의 주근에 전체적으로 퍼져 있으며 주로 식물체가 끊어진 부분에서 자주 관찰되었다. 단일 균주 세포들은 뿌리 외피나 주근이 분열되어 부근이 생성되는 부분에 모여 있다. 뿌리 표면에 있는 미생물은 뿌리표면과 미생물이 실모양의 물질로 연결되어있는 것이 관찰되었다. 토마토의 잎을 전체적으로 보면 많은 단일 세포들이 흩어져 있지 않고, 선형을 띄는 것을 볼 수 있다. 단일 혹은 군집을 이루는 세포들은 잎 표면의 세포사이나 기공에서도 관찰하였다. 뿌리에 있는 세포들처럼 토마토의 잎 부분에 서식하는 미생물 역시 잎 표면과 실모양의 물질로 연결되어 있음을 확인하였다.
토마토와 벼에서의 존재하는 CBMB120-gfp29의 밀도는 kanamycin이 첨가된 AMS 선택 배지에서 확인 할 수 있었다. 이 선택 배지에, 미접종한 대조군 작물과 CBMB120 균주를 접종한 작물에서 획득한 샘플의 밀도는 확인 하지 않았다. 벼의 경우 전체 균주 밀도는 근권, 옆면, 작물내부 보다 근권토에서 높게 나타났다. CBMB120-gfp29 균주의 밀도는 근권이 근권토, 옆면 보다 높았다. 또한 벼의 뿌리와 잎의 내부에서도 균주가 존재 하였다. 토마토에서 전체 균주와 CBMB120-gfp20의 밀도는 30일 동안 확인하였으며 표 16에 나타냈다. CBMB120-gfp20의 밀도는 처음 두 번 채취한 샘플에서는 일정하였으나 세 번째 채취한 샘플에서는 뿌리 내부를 제외한 다른 부분에서 균주의 밀도가 감소하는 경향을 보였다. 그러나 뿌리와 줄기의 내생균주의 밀도는 모든 균의 밀도와 비슷하거나 더 많이 존재하였다. 이러한 결과는 접종된 균주가 식물체에 존재하는 다른 자연적인 균주와 경쟁하여 살아남을 수 있다는 것을 명확히 보여 준다.
균주의 형질전환을 위하여 biparental과 triparental mating 기술과 electroporation 기법을 적용하였다. Biparental mating을 이용하여 pLA-lacZ, pFAJ1819 또는 pFAJ1820이 들어있는 E. coli S17-1을 donor cell로 이용하여 Methylobacterium oryzae 중 CBMB20, CBMB110 strain, Azospirillum brasilense 중 CW301, CW903 strain, Azospirillum lipoferum 중 CW1503 strain을 형질전환 하였고, triparental mating기술을 이용하여 pFAJ1819와 pFAJ1820이 들어있는 E. coli S17-1의 donor cell과 helper strain인 HB101을 이용해 A. brasilense 중 CW301, CW903 strain을 형질전환 하였으며, electroporation을 이용하여 M. oryzae CBMB20 strain에 pYL201을 도입하였다.
형질전환 된 개체를 선별하기 위해 PCR 분석을 수행한 결과 우리가 도입한 vector가 recipient cell에 삽입되었음을 알 수 있었고, 식물체에 접종하기 위해 요구되는 gfp발현 정도를 콘포칼영상분석기기(CLSM)과 유세포분류기(FACS)를 이용하여 측정하였다. 그 결과 gfp형광의 발현정도가 cell line에 따라 크게 다르게 나타남을 알 수 있었고 CLSM 촬영에서 pFAJ1820이 삽입된 M. oryzae CBMB20이 발현정도가 강하고 FACS 측정값도 97.9%로 가장 높은 수치를 나타내어 식물체에 접종하기 위한 형질전환체로 이 균주를 선택하였다.
균주에 삽입된 vector의 안정성을 확인하기 위하여 형질전환체를 항생제가 없는 배지에 일정 기간 동안 계대 배양하여 콜로니 PCR 검정을 수행하였다. 이것으로 균주에 삽입된 vector가 최소한 45일, 15계대배양 동안 안정하게 균주 내에서 보존된다는 것을 알 수 있었다. 또한 균주를 여러 가지 토양에 처리하고 항생제 배지를 이용하여 형질전환된 균주만을 선별할 수 있었으며, 토양에서도 균주가 최소 2주간 균의 수에 큰 변화가 없이 보존될 수 있음을 알 수 있었다.
균주와 작물의 공생관계를 확인하기 위하여 형질전환 된 균주를 배양 후 세척하여 엽면시비 및 근권접종과 종자침지법을 이용한 두 가지 방법으로 균주를 고추에 처리하여 처리일수에 따른 촬영으로 처리된 균주의 공생을 확인하였다 CLSM . 엽면시비 및 근권접종에서 균주는 잎 내부에서 군집을 이루어 공생하고 있었으며 줄기에서는 개체별로 존재하고 있음을 알 수 있었다. 또한 뿌리에서도 엽 내부에서와 마찬가지로 군집을 이루어 공생하고 있음을 알 수 있었다. 종자침지법으로 처리된 고추에서는 접종된 균주가 잎 내부에서 균일하게 퍼져 공생하고 있음을 알 수 있었고 줄기와 뿌리에서는 개체별로 존재함을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 작물의 엽면시비 및 근권접종보다 종자침지법으로 접종된 균주가 작물에서 균일하게 공생한다는 것을 알 수 있었다. 작물과 형질전환 된 균주의 공생관계를 관찰하기 위한 CLSM측정과정에서 gfp로 형질전환 된 균주의 gfp 발현이 시간이 지남에 따라 그 발현량이 적어지는 것을 확인하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해 형질전환 된 균주의 정량적 분석을 위한 추가적인 실험이 필요하다고 생각되었다.
Real-Time PCR은 확인하고자 하는 DNA의 증폭산물을 실시간으로 확인하고 그 증폭산물의 정량적 분석을 위한 시스템이다. 이 시스템을 이용하여 식물체에 존재하는 형질전환 균주의 수를 정량적으로 측정할 수 있었다. Real-Time PCR 분석을 위하여 형질전환에 쓰였던 vector의 gusA와 nptⅡ에 각각 결합되는 primer를 제조하였다. 고추에 접종된 균주의 DNA를 추출하기 위하여 다양한 방법으로 공생 미생물의 DNA추출을 시도한 결과 plant genomic DNA 추출 kit에 lysis buffer를 첨가한 방법에서 작물 내에서 공생하는 미생물의 DNA가 가장 효과적으로 추출된다는 결과를 얻을 수 있었다. 엽면시비 및 근권접종으로 시비한 고추와 종자침지법으로 시비한 고추의 두 가지 처리구에서 제 1 본엽, 제 2 본엽, 제 3 본엽으로 나누어 실험하였고, Real-Time PCR 실험결과 엽면시비 및 근권접종으로 시비한 고추보다 종자침지법으로 시비한 고추에서 균주의 수가 많다는 것을 알 수 있었다. 또한 균주 처리 후 12주가 경과한 고추의 잎에서도 균주가 검출되어 한번 접종된 균주가 계속해서 식물내에 공생하고 있다는 사실을 증명할 수 있었다.
고추, 토마토, 상추, 벼를 종자침지법으로 균주를 처리한 후 생육을 관찰하였다. 각각의 종자 발아율에서는 유의성 있는 차이가 보이지 않았지만 A. brasilense CW903으로 처리한 고추의 생육관찰 결과 무처리보다 전장의 길이가 유의성 있는 차이를 보이는 것으로 관찰되었다. 실험 결과에 따르면 공생균은 각종 토양에서 안정적으로 생존할 수 있으며, 엽면시비 및 근권접종 보다 종자침지법으로 시비한 식물에서 균주가 식물의 부위별로 균일하고 많은 수로 존재하며 접종 후 수 개월 동안 식물체내에 존재하고 있다는 사실을 알 수 있었다.
실물생장촉진능력이 높은 2종의 Methylobacterium과 2종의 Azospirillum을 선발하여 최적의 탄소원과 질소원을 결정하고 대량배양을 위한 적정조건을 알아보기 위해 균밀도를 측정하였다. 연구수행결과, 여러 탄소원 중 포도당에서, 여러 질소원 중 대두분에서 균밀도가 가장 높게 나타났다. Methylobacterium의 경우 포도당과 대두분의 첨가량이 2%일 때, Azospirillum의 경우 포도당이 2%, 대두분이 3%일 때 최적의 결과를 보였다. 시판배지(DIFCO Bacto TM - Tryptic soy broth(TSB), Luria broth(LB), (Nutrient broth(NB), Potato dextrose broth(PDB))와 선발배지(Methylobacterium용(Glucose 2.0%, 대두분 2.0%))과Azospirillum용(Glucose 2.0%, 대두분 3.0%))에서의 배양결과 큰 차이가 없었으며 이 결과로 제조된 배지가 경제적인 산업용 배지로서 활용가치가 클 것으로 생각된다. 최적의 배양조건은 27℃, pH7.0, 1.0vvm, 150rpm으로 나타났다. 최적 배지 및 조건하에서 대량배양용 Fermenter(500ℓ)보다 Jar-Fermenter(5ℓ)에서 균밀도가 높았다.
Methylobacterium (CBMB20), Azospirillum (CW301) 각각의 균주의 액상 제제화를 위한 후보물질로서 EDTA.2Na 와 MgSO₄7H₂O 선별하였다. EDTA.2Na는 0.5 - 1.0%에서의 농도 변화에 의하여 큰 변동이 없었으나 0.5% 농도에서는 용기팽창현상이 약하게 나타났으며 MgSO₄.7H₂O역시 25 - 35% 범위에서의 농도변화에 의하여서는 급격한 차이가 나타나지 않았지만 25%농도에서는 30%에 비하여 생존율의 변화가 많이 나타났다. 또한 Methylobacterium (CBMB20), Azospirillum(CW301) 두 균주의 액상 생물비료를 사용함에 있어 엽면시비의 효율을 높이기 위한 방법으로 강구하기위하여 현재 시중에서 사용되고 있는 전착제(계면활성제)와의 혼용이 생물비료의 생존율에 미치는 영향을 검토하였다. 두 균주 배양액에 사용 권장량 (1,000배 - 5,000배 )의 농도로 첨가 혼합한 후 30℃에서 24시간 후 각각의 균주에 대한 생존율을 비교한 결과 Methylobacterium (CBMB20), Azospirillum (CW301)두 균주에 대하여 시험구 모두 무처리구에 비하여 균질도의 증가 등으로 생균수는 약간씩 증가하는 현상을 나타내었다. 따라서 본 생물비료의 사용 시에는 전착제의 혼용이 시비효율면에서 적극 권장되어야 할 것으로 사료된다.

Abstract ▼

To realize environmentally friendly farming, development of new agricultural materials which are non-infecting and which stimulate the growth of plants in a symbiotic relationship have been interesting. One method of accomplishing this is the utilization of microbial materials. Many research project

To realize environmentally friendly farming, development of new agricultural materials which are non-infecting and which stimulate the growth of plants in a symbiotic relationship have been interesting. One method of accomplishing this is the utilization of microbial materials. Many research projects have been focused on developing effective microbial materials.
Three-plant growth promoting $N_2$-fixing methylotrophic strains isolated from rice cultivars (Oryza sativa L.) viz, Methylobacterium Oryzae $CBMB20^T$, Enterobacter sp. CBMB30, Burkholderia sp. CBMB40 were selected and their activities in promoting the early growth of rice were studied. Seeds treated with the methylotrophic strains improved seed germination, seedling vigour index and biomass of rice seedlings. The methylotrophic population in the treated seedlings increased in the vegetative stages when compared to seeding stages. Treated seedlings, showed a higher accumulations of plant hormones viz, trans-zeatin riboside, isopentenyladenosine and indole-3-acetic acid than untreated seedlings, Plant hormones were detected immunologically using the phytodetek kit. Conformational evidence suggested that cytokinins were produced by the epiphytic bacteria colonizing the plants rather than by the plants themselves. In addition, the inoculated early stage rice seedlings also exhibited a wide range of acetylene reduction activity. The results suggest the potential use of these bacteria to stimulate germination, seedling vigour index and biomass production, which is mediated by production of plant hormone accumulation and nitrogen fixation.
The present greenhouse study was undertaken to evaluate the effects of co-inoculating methylotrophic Methylobacterium oryzae CBMB20 along with N fixing Azospirillum brasilense CW903 on the growth and nutrient uptake of red pepper. Seed bacterization and soil/foliar application of the bacterial strains alone or under dual inoculation increased the plant growth in terms of shoot or root length and increased the nutrient uptake in the plants studied compared to uninoculated control plants. Co-inoculation of M. oryzae CBMB20 with A. brasilense CW903 improved the N and P concentration of plants, with the results being variable among the plant species tested. Also, co-inoculation of the bacterial strains increased the activity of nitrogenase, urease and phosphatase enzymes in soil when compared to uninoculated control or individual inoculations. The results also clearly revealed that the inoculated microorganisms are compatible in the rhizosphere. Our results suggest the potential use of Methylobacterium as bioinoculants either alone or with other groups of PGPR to promote the plant growth and nutrient uptake in sustainable agriculture production systems.
The localization of bacterial cell, pattern of colonization and survival of Methylobacterium suomiense CBMB120 in the rhizosphere of rice and tomato plants were followed by Confocal laser scanning (CLSM), scanning electron (SEM) microscopy and selective plating. M. suomiense CBMB120 was tagged with green fluorescent protein (gfp) and inoculation was carried out through seed source. The results clearly showed that the gfp marker is stably inherited and is expressed in planta allowing for easy visualization of M. suomiense CBMB120. The colonization differed in rice and tomato - intercellular colonization of surface sterilized root sections was visible in tomato but not in rice. In both rice and tomato, the cells were visible in the substomatal chambers of leaves. Furthermore, the strain was able to compete with the indigenous microorganisms and persist in the rhizosphere of tomato and rice, assessed through dilution plating on selective media. The detailed ultra-structural study on the rhizosphere colonization by Methylobacterium put forth conclusively that M. suomiense CBMB120 colonize the roots and leaf surfaces of the plants studied and is transmitted to the aerial plant parts from the seed source.
Biparental and triparental mating technology and electroporation technique were used for bacterial transformation. pLA-lacZ, pFAJ1819 and pFAJ1820 were introduced to Methylobacterium oryzae CBMB20, CBMB110 strain, Azospirillum brasilense CW301, CW903 strain, and Azospirillum lipoferum CW1503 strain by biparental mating using E. coli S17-1 as donor cells. pFAJ1819 and pFAJ1820 were transferred to A. brasilense CW301, CW903 strain by triparental mating using E. coli S17-1 as donor cells and HB101 as a helper strain. pYL201 was introduced to M. oryzae CBMB20 strain by electroporation.
Transformants were confirmed by PCR analysis and the gfp expression level was analysed by confocal laser scanning microscopy (CLSM) and flow cytometer (FACS). The gfp expression levels were various according to the cell strains and used vectors. We selected the strain M. oryzae CBMB20 transformed by pFAJ1820 for further studies because it showed highest gfp intensity level by CLSM and highest transformant ratio, 97.9%, by FACS.
The stabilities of introduced genes were tested by colony PCR using the strains subsequently subcultured on antibiotics free medium. The genes were stably inherited at least 45 days and 15 subcultures. We could separated the transformed cells from the soil using the medium containing antibiotics. Applied cells survived at least 2 weeks from soil without dramatic population changes.
We treated transformed cells to red pepper using two methods, foliar application and seed dipping methods, to test the symbiosis between the bacteria and plant and visualized using CLSM. From the plants treated by foliar application, bacteria existed in group from leaves and in single in stems. We also found the cells from the surface of roots. From the plants treated by seed dipping method, bacteria were evenly distributed all over the leaves, but they are existed in single from the shoot. We found that the gfp signal intensity of the transformed cells varies according to the situation of the cells. Especially, the signal decreased in time-dependent manner after transformation. Therefore, we could not use the gfp signal for bacteria counting and needed a method to quantitate the symbiotic bacteria.
Real-Time PCR technique is for quantitate the PCR product. We adopted this technique for counting the number of bacteria cells existing in plants. We designed PCR primers attaching to the genes, gusA and nptⅡ, of the vector used for transformation. We tried various methods to extract the DNAs of symbiotic bacteria. Plant genomic DNA kit extraction method pre-treated by lysis buffer was the best for bacteria genomic DNA extraction. We counted the bacteria using Real-Time PCR from the plants treated bacteria by foliar application and seed dipping methods. The numbers of bacteria cells from the leaves were larger from the plants treated by seed dipping methods than from the plants treated by foliar application. We could detected the bacteria from the leaves of red pepper plants which were treated with bacteria 12 weeks before. So it was proved that the treated bacteria constantly exist from the plants for a long time.
We measured the growth of red pepper, tomato, lettuce, and rice plants after bacteria treatment by seed dipping. Bacterial treatment did not show significant difference on germination rate, but the total length of red pepper was increased by A. brasilense CW903. In summary, plant symbiotic bacteria can constantly survive for several weeks from soil and several months from plant, and seed dipping treatment is better than foliar application because the bacteria evenly distributed all over the plant organs.
Methylobacterium and Azospirillum are known as bacterial symbionts of plants, shown previously to participate in plant metabolism by consuming plant waste products and producing metabolites useful to the plants. Therefore, the specific aim of this study was to investigate the optimal conditions for the mass production of methylotrophic bacteria. Two kinds of Methylobacterium spp. and two kinds of Azospirillum spp. which have high $N_2$-fixing ability were isolated and selected for this study. Optimal C and N sources were determined to identify the optimal conditions for the mass production and measured the colony-forming unit under various conditions. To produce a high CFU of the selected bacteria, glucose was found to be the most effective carbon source, soybean powder was the most effective nitrogen source. In the case of Methylobacterium spp., the most effective results were found at 2% of glucose and soybean powder respectively. As for Azospirillum spp., 2% for glucose and 3% for soybean powder. There were no outstanding differences in the population between the commercial media, DIFCO BactoTM - TSB, PDB, LB, NB, and the medium made for this study. From these results, the medium made for this study is expected to be useful and economical for mass production. The optimum fermentation conditions for the selected bacteria were $27^{\circ}C$, pH7.0, 1.0vvm and 150rpm.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 15
• CONTENTS ... 20
• 목차 ... 21
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 22
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 25
• 제 3 장 연구개발내용 및 결과 ... 27
• 제 1 절 식물생장 조절물질 대량생산 미생물 2차 선발 ... 27
• 제 2 절 PGR 생성균의 최적 접종방법 설정 ... 36
• 제 3 절 포장실험을 통한 점종 효과 검증 및 사용법 확인 ... 48
• 제 4 절 유전자 조작을 이용한 형질전환 PGR 생성균 제조 ... 65
• 제 5 절. 형질전환 PGR 생성균을 이용한 토양 내 생존율 확립 ... 79
• 제 6 절. 균주와 작물의 상호작용 ... 88
• 제 7 절 균체대량생산을 위한 산업용 배양 조건 확인 ... 110
• 제 8 절 액상 생물 비료의 제제화 조건 확립 ... 131
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 139
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 144
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 145
• 제 7 장 참고문헌 ... 152
• 끝페이지 ... 168