한국산 겨우살이 렉틴의 작물 발현 생산과 항암 및 면역 활성 증진 효능 연구 Production of Korean mistletoe lectin expressed in crop plants, and its anticancer and immunostimulatory activities원문보기
보고서 정보
주관연구기관
성균관대학교 SungKyunKwan University
보고서유형
최종보고서
발행국가
대한민국
언어
한국어
발행년월
2007-08
과제시작연도
2006
주관부처
농림부 Ministry of Agriculture and Forestry
등록번호
TRKO201400022811
과제고유번호
1380000281
사업명
농림기술개발
DB 구축일자
2014-11-10
초록▼
○ 연구결과 한국산 겨우살이로부터 이온교환수지와 흡착 크로마토그래피를 이용하여 정제된 렉틴을 다양한 종류의 암세포에 처리하여 항암 효과에 대한 활성을 조사하였다. 정제된 KML은 암세포 및 혈관내피세포의 형태 변화, 망상구조 형성 저해 및 이동성 감소를 유도하고 암세포 특이적으로 높은 세포 독성을 보였다. 혈관신생 관여 인자의 발현량이 농도 의존적으로 감소하였으며, 세포외기질 분해 효소 활성 역시 감소하는 것을 확인하였다. 암세포의 성장 억제 및 항암효과를 보일 수 있는 단백질의 증가 추이를 확인할 수 있었다. 암세포에서 KM
○ 연구결과 한국산 겨우살이로부터 이온교환수지와 흡착 크로마토그래피를 이용하여 정제된 렉틴을 다양한 종류의 암세포에 처리하여 항암 효과에 대한 활성을 조사하였다. 정제된 KML은 암세포 및 혈관내피세포의 형태 변화, 망상구조 형성 저해 및 이동성 감소를 유도하고 암세포 특이적으로 높은 세포 독성을 보였다. 혈관신생 관여 인자의 발현량이 농도 의존적으로 감소하였으며, 세포외기질 분해 효소 활성 역시 감소하는 것을 확인하였다. 암세포의 성장 억제 및 항암효과를 보일 수 있는 단백질의 증가 추이를 확인할 수 있었다. 암세포에서 KML에 의해 세포분열 억제 및 사멸 징후를 확인하였다. 특히 활성을 보이는 렉틴의 유전자를 분리하여 대량발현을 위한 미생물 및 작물 발현 시스템을 E.coli와 감자, 토마토, 담배를 이용하여 확립하였다. KML은 LPS에 의해 활성화된 대식세포의 기능을 억제하는 것으로 나타났다. 하지만 KML의 병용투여는 LPS에 의해 유도되는 TNF-α 및 ROS 생성은 유의적으로 증가시켰다. KML의 단독투여는 대식세포 유래IL-3 및 IL-23 발현양, 탐식과정, 세포내 면역조절 표면단백질, adhesion molecules의 발현량 및 CD29-매개성 세포유착과정 등을 촉진시켰으며, 이는 ERK 및 p60의 활성을 통해 매개되는 것으로 확인되었다. 임파구의 경우 분열이 촉진되지 않고, CD3 유래 T cell분열 과정을 억제하였다.
Abstract▼
Lectin from Korean mistletoe (KML) was purified by ion exchange and Concancvalin A affinity chromatography. Effects of purified KML were assessed in a various kinds of cancer cells. KML treated groups showed morphological changes and cancer cell-specific cytotoxicity compared to non-treated groups.
Lectin from Korean mistletoe (KML) was purified by ion exchange and Concancvalin A affinity chromatography. Effects of purified KML were assessed in a various kinds of cancer cells. KML treated groups showed morphological changes and cancer cell-specific cytotoxicity compared to non-treated groups. In HUVEC system, it also showed morphological changes and clearly inhibited migration, as similarly shown in CAM assay. KML exposure also diminished the expression of pro-/angiogenic factors in a dose dependent manner. Enzyme activities essential for ECM degradation also inhibited under KML treatment. By using proteomic analysis, we observed significant increase of some proteins related to tumor suppression. In addition, blockade of DNA synthesis, alteration of nuclear structures (such as condensed chromatin) and PI staining pattern observed by flowcytometric analysis indicated its role as an inducer of apoptosis. Therefore, these data suggested that KML may have strong anticancer activity. To produce transgenic crops, KML-coding gene was first isolated by RT-PCR from cDNA library and the crop expression system was continuously established for the mass production of rKML in potato, tobacco, and tomato. Indeed, we confirmed higher expression of rKML from the genetically modified prokaryote and crops by SDS-PAGE, suggesting that we are able to produce this useful protein by mass cultivation of these transgenic crops. Even though it has been shown to boost host immune defense mechanisms, the immunomodulatory effects of KML on specific immune responses mediated by macrophages and T cells have not been fully elucidated. Therefore, in this study, we aimed to demonstrate KML's regulatory roles on macrophage and T cell-mediated immune responses. KML clearly blocked lipopolysaccharide (LPS)-induced events [expression of interleukin (IL)-10, nitric oxide (NO) production and phagocytic uptake], and suppressed the normal expression levels of IL-10 (at 2 ng/ml) and tumor necrosis factor (TNF-$\alpha$) (at 10 ng/ml). In contrast, (1) the expression of cytokine (TNF-$\alpha$) and (2) the generation of reactive oxygen species (ROS) induced by LPS were significantly up-regulated by KML co-treatment. In addition, KML itself increased the mRNA levels of IL-3 and IL-23; phagocytic uptake; the surface levels of co-stimulatory molecules (CD80 and CD86), pattern recognition receptors (PRRs) [such as dectin-1 and toll like receptor (TLR)-2] and adhesion molecules [$\beta$1-integrins (CD29) and CD43]; and CD29-mediated cell adhesion events. The up-regulation of IL-3 seems to be mediated by the activation of ERK and p60 kDa, as assessed by their phosphorylation level. In contrast, KML did not induce T cell proliferation, while various mitogens (LPS, Con A and PHA) did. Rather it doese-dependently suppressed CD3-mediated T cell proliferation. Therefore, these data suggest that KML may preferentially participate in regulating various macrophage (but not lymphocyte)-mediated innate and adaptive responses and that some of these may deserve in KML's therapeutic activities such as anti-tumor and anti-microbial effects. Taken all together, our data suggest that lectin extracted from Korean mistletoe can exhibit anticancer effects directly via inhibition of angiogenesis and the expression of angiogenesis-promoting genes, induction of cancer cell-specific cytotoxicity, arresting cell cycle and boosting apoptosis and indirectly via up-regulating some anti-cancer immune responses mediated by macrophages but not T cells. Finally, our transgenic crop system will be useful to over-produce the biologically active rKML for developing its medical applications and to apply to establish other novel or functional crops with an industrial worth.
목차 Contents
제출문 ... 1
요약문 ... 2
SUMMARY ... 4
CONTENTS ... 6
목차 ... 7
제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
제1절 연구개발의 필요성 ... 8
제2절 연구개발의 목표 및 내용 ... 10
제2장 국내외 기술개발 현황 ... 17
제1절 국내·외 관련기술의 현황과 문제점 ... 17
제2절 앞으로의 전망 ... 17
제3절 기술도입의 타당성 ... 18
제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 19
제1절 제1세부과제 : 성균관대학교 유전공학과 홍성렬 한국산 겨우살이 렉틴의 항암, 혈관신생 억제 효능 및 작용 기전 연구 ... 19
제2절 제2세부과제 : 성균관대학교 유전공학과 권무식 한국산 겨우살이 렉틴의 유전자 분리 및 작물 발현 시스템 개발 ... 49
제3절 협동과제 강원대학교 생물소재공학과 조재열 한국산 겨우살이 렉틴의 면역 활성 증진 효능 및 작용 기전 연구 ... 82
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