초록 ▼

○ 연구결과
국내 이유 자돈의 장내 미생물 균총을 이루는 주요 5종의 미생물을 선정하여, 이에 대한 분자 생물학적 기법을 이용한 자돈의 장내 미생물 수 측정 방법을 개발하였다. 소량의 DNA의 정량에도 민감한 SYBR green 시약을 이용한 형광 발색법으로 standard plasmid DNA의 농도를 측정하는 real time PCR 기법(Joseph 등, 2003)을 이용하여 자돈의 장내 미생물 균총 측정기법을 확립하였다.
Lactobacillus casei CLW-011의 종 특이적 primer를 이용하여 증폭시킨

○ 연구결과
국내 이유 자돈의 장내 미생물 균총을 이루는 주요 5종의 미생물을 선정하여, 이에 대한 분자 생물학적 기법을 이용한 자돈의 장내 미생물 수 측정 방법을 개발하였다. 소량의 DNA의 정량에도 민감한 SYBR green 시약을 이용한 형광 발색법으로 standard plasmid DNA의 농도를 측정하는 real time PCR 기법(Joseph 등, 2003)을 이용하여 자돈의 장내 미생물 균총 측정기법을 확립하였다.
Lactobacillus casei CLW-011의 종 특이적 primer를 이용하여 증폭시킨 target DNA가 삽입된 Vector 제작 및 Real time PCR 기법으로 정량 분석을 실시하였으며, Lactobacillus casei를 비롯한 총 5균종(Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Streptococcus bovis, E.coli K88)에 대한 해당 균주 특이적 primer를 이용해 vector를 제작하였고, 종 특이성을 위한 검증실험이 수행되었다. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응을 위한 standard는 증폭 DNA 염기서열로 유전자 재조합된 순수 배양 E. coli로부터 추출된 plasmid DNA를 연쇄 희석하여 확보하였다. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응에는 iCycler® Optical Module (Bio-Rad, USA)과 iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, USA)가 사용되었다. 미생물 4종 중 Streptococcus bovis와 E. coli에 대한 정량분석 결과, 99.6%와 95.3%의 중합효소연쇄반응 효율과 1.000과 0.999의 상관계수가 각각 도출되었다.
이유자돈사료에 sugar beet pulp를 소량 첨가하여 성장능력, 혈중요소태 질소, 장의 형태학적 고찰을 하였으며, sugar beet pulp가 자돈의 성장능력, BUN, 장의 morphology에 미치는 영향에 대해 조사하였으며, 총 5종의 확립된 real time PCR 정량 기법을 이용하여 sugar beet pulp 섭취시 장내 미생물 균총에 대해 조사하였다. 또한 sugar beet pulp 첨가로 인한 소화율, 질소 이용율을 구하고, morphology 및 미생물 균총 조사를 통해 장내 면역반응의 상관관계 구명하여, SBP의 수준별 급여 (0~10%)가 자돈의 영양소 소화율, 질소 이용율에 미치는 영향 및 면역반응 유도물질인 LPS를 주입하였을 때 체온 및 면역능력(Ig A, Ig G)의 변화에 대한 조사 연구를 마쳤다. 본 1년차 연구과제에서 확립한 분자생물학적 기법을 통한 미생물 정량화 분석법을 이용하였다. Sugar beet pulp를 5% 이상 첨가하였을 때, 성장 개선 효과가 체중, 일당 증체량, 사료효율에서 나타났으며, 장내 미생물 균총에서도 sugar beet pulp 첨가구에서 유익균인 L. casei, L.plantarum, S. bovis, B. subtilis가 대조구에 비해 높은 경향을 보였다. 또한 소장의 morphology에서도 sugar beet pulp를 첨가한 첨가구의 융모의 높이와 융와의 길이가 커지는 경향이 관찰되었다. 위의 결과를 통해, sugar beet pulp의 5% 이상의 첨가가 장내 미생물 균총의 변화를 유도하여 자돈의 성장 및 건강 능력을 개선할 수 있는 것으로 사료된다.
이유자돈 사료에 무기산제가 이유자돈의 성장, 혈중요소태질소, 설사 발생 빈도 및 장내 미생물 균총에 미치는 영향에 대한 조사를 수행하였으며, 무기산제의 섭취가 영양소 소화율 및 질소 대사, 휘발성 지방산 발생정도에 대한 연구가 병행되었다. 또한 무기산제가 이유자돈의 면역 능력에 미치는 영향에 대해 조사하였다.
실험 전 기간(5 주) 동안 사료내 무기산제를 첨가한 HCl 0.1% 처리구와 항생제 처리구에 있어일당증체량이 통계적 유의적으로 가장 높았다. 2~3주차에는 HCl 0.1% 처리구가 유의적으로 가장 낮은 수치를 보였으며, 항생제 처리구는 이보다 높았다. 장내 미생물균총 분석은 본 1년차 과제에서 수행한 분자생물학적 기법을 통해 정량분석 하였다. 실험 전 기간(5 주) 동안 사료내 무기산제를 첨가한 HCl 0.1% 처리구와 항생제 처리구에 있어 일당증체량이 통계적 유의적으로 가장 높았다. Bacillus subtilis의 경우 회장에 있어서 항생제 처리구와 무기산제 0.1% 처리구에서 유의적으로 낮은 Ct value를 나타내었으며, Lactobacillus casei의 경우에는 맹장에서 HCl 0.1% 처리구에서 Ct value가 높게 나타났다. 무기산제 0.1%를 첨가한 처리구가 Bacillus subtilis의 경우 회장에 있어서 다른 무기산제 처리구에 비해 유의적인 차이를 보이며 높았으며, 이는 일일 증체량과 면역력이 무기산제 0.1% 첨가한 처리구가 다른 처리구에 비해 유의적으로 개선된 결과와 일치한 결과였다.
자돈의 장내 미생물 균총에 대한 산제의 효과로서 항생제 첨가구와 비슷한 미생물 균총을 유지하는 것으로 나타나 산제가 자돈의 장내 건강 상태 유지에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 0.3%의 무기산제 첨가에는 w자돈의 면역 능력이나 설사 등에서 부정적인 영향이 미세하게 나타났으며, 따라서 0.1%의 무기산제 첨가가 가장 적정 수준이라고 사료된다.
최종적으로 real time PCR 기법을 이용하여 단위동물인 돼지의 소장내 미생물 수에 대한 standard 계산식을 정립하는데 성공하였으며, 이를 기반으로 이유 자돈의 성장 및 면역 능력, 장내 미생물 균총의 개선에 효과적인 sugar beet pulp와 무기산제가 갖는 개선 효과에 대해 규명하였다. 특히 sugar beet pulp는 섬유소의 첨가로 인한 설사 예방효과가 있으며, 특히 prebiotics의 개념이 도입되어 유익균의 성장 배지로써 이용이 가능하여 그 효과가 나타나고 있으며, 무기산제는 위내 pH를 낮춤으로써 단백질 소화율의 개선, 이를 통한 장내미생물 균총의 유지 및 조절 효과를 가질 수 있었다. 생균제용으로 개발된 Lactobacillus plantarum을 이용한 자돈 장내 특이적 유산균의 활용도 측정에 대해서도 조사하였다. 따라서 본 연구를 통해 자돈의 영양적 설사예방을 위한 장내 미생물 균총의 측정 방법이 확립되었다고 하겠다.

Abstract ▼

The GI tract of the swine is an active environment with fermenting microorganisms, both aerobic and anaerobic microbes, and digestive enzymes. Researches on the structure and function of the microbiota of the GI tract and the activities of these micro-organisms are needed for the development of feed

The GI tract of the swine is an active environment with fermenting microorganisms, both aerobic and anaerobic microbes, and digestive enzymes. Researches on the structure and function of the microbiota of the GI tract and the activities of these micro-organisms are needed for the development of feed supplemented antibiotic alternatives such as probiotics or prebiotics. Most of the research on GI tract microbiota of the swine has been conducted by traditional culturing methods, and the results from the cecal and coloic samples of the growing pigs showed that the majority of the microbiota are strictly anaerobic and gram-positive(Stewart, 1997). But considerable number of strictly anaerobic bacteria were difficult to culture by traditional methods, thus stand in the way for analyzing many other bacteria species. This problem could be overcome by molecular biological analytical methods. While traditional culturing methods could only analyze live micro-organisms, molecular methods target extracted DNAs or RNAs, providing the solution to such limitation. This methodical change was rapidly developed following the introduction of 16S ribosomal RNA(rRNA) as the marker for micro-organism classification by Woese(1987). This method has been recently introduced to the GI tract micro-organism research area, and suggested new hypothesis that the intestinal environment is affected by supplemented feed and the host itself.
Young pigs are generally weaned approximately at 21 days old from commercial farms, facing sudden change in feed and translocated to large scale production facilities. These complex stress factors caused piglet diarrhea or growth retardation. Antibiotics were supplemented to prevent such growth retardation and micro-organism oriented diarrhea(Cromwell, 2002). But the use of antibiotics in the livestock industry revealed the danger of antibiotic resistance of micro-organisms present in both livestock and human, creating public worries, thus increasing the need for researches on antibiotic alternatives such as probiotics and prebiotics. This need also stimulated nutritional knowledge as well as other factors influencing the microbiota. As invasive pathogens are influenced by the animal`s condition, including the microbiota, it will be possible to prevent the invasion of pathogenic bacteria by finding factors that are responsible for the change of microbiota. A method for an accurate observation of the microorganism shift has to be preceded via controlling the microbiota.
In the first experiment, a method was established using real-time PCR, one of the methods favored as micro-organism detecting tools, for detection of the microbita in the gastrointestinal tract of pigs such as E.coli K88, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis, and Streptococcus bovis.
A culture independent quantitative real-time PCR method was evaluated for enumeration of the bacteria species E.coli K88, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis, and Streptococcus bovis from intestinal samples of weaning pigs. Total genomic DNA was extracted by bead-beating method using the Ultra $Clean^{TM}$ Dry Soil Kit (MoBio, USA). Species-specific primer sets of E.coli K88 and S. bovis were designed and tested for species-specificity. The standard for real-time PCR was established by serial dilution plasmid of DNA concentration from pure cultured transgenic E. coli which contained target DNA sequence. The quantification of DNA (as DNA copy/g samples) by real-time PCR was performed with $iCycler^{(R)}$ Optical Module (Bio-Rad, USA) using the $iQ^{TM}$ $SYBR^{(R)}$ Green Supermix (Bio-Rad, USA). The result showed 1.000 (S. bovis), 0.999 (E. coli K88+) of correlation coefficient, indicating high reliability.
In the second experiment, a method was established using real-time PCR, one of the methods favored as micro-organism detecting tools, for evaluation of the effect of various supplementation levels of sugar beet pulp(SBP) on the microbiota shift in weaning pigs. Sugar beet pulp, by-product of the sugar industry, is characterized by a high non-starch polysaccharides content and a low level of amino acids, minerals and lignin. One of the alternatives for antibiotics could be the concept of prebiotics. The concept is based on the phenomenon of colonial resistance, in which beneficial bacteria control opportunist pathogens, mainly through secretion of volatile fatty acids and competition for nutrients and binding sites . And fiber source can stimulate intestinal secretion and intestinal epithelial cell proliferation. Due to the good quality and high digestibility of the fibrous fraction, SBP can partially be used to pig’s diet as prebiotics. Therefore, the object of this study was to evaluate the effect supplementation of beet pulp as prebiotics on growth performance nutrient digestibility, intestinal morphology, and microflora in the gastrointestinal tract of weaning pigs. A culture independent quantitative real-time PCR method was evaluated for enumeration of the bacteria species L. casei, L. plantarum, S. bovis, B. subtilis, E. coli K88+ from intestinal samples of weaning pigs. Total genomic DNA was extracted by bead-beating method using the Ultra $Clean^{TM}$ Dry Soil Kit (MoBio, USA). Species-specific primer was designed for each bacterium and tested for species-specificity. The standard for real-time PCR was established by serial dilution plasmid of DNA concentration from pure cultured transgenic E. coli which contained target DNA sequence. The $iCycler^{(R)}$ iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) generates a standard curve vs. log DNA concentration for all standards and determines the DNA concentration of unknowns by interpolation. The result showed 0.9992 (L. plantarum), 0.9994 (B. subtilis), 0.9978 (S. bovis), 0.9975 (E. coli K88+), 0.9949 (L. casei,) of correlation coefficient, indicating high reliability. The CT value of Bacillus subtilis, S. bovis in the jejum and colon digesta of pigs was significant lower in SBP supplementation groups by real-time PCR method. Therefore, it could indicate that addition of SBP to weaning diet might increase the population of health promoting bacteria. During the whole experimental period, body weight (BW), average daily gain (ADG) and feed efficiency (G/F ratio) in 5.0, 7.5, 10.0 % SBP supplementation groups were higher (P<0.05) than those of control group, especially for the first 3 weeks. From this study, supplementation of SBP as prebiotics was positive effect on growth performance and intestinal microflora of weaning pig.
In the third experiment, it was to evaluate the effect supplementation of inorganic acidifier on growth performance nutrient digestibility, intestinal morphology, and microflora in the gastrointestinal tract of weaning pigs using real-time PCR, one of the methods layered as micro-organism detecting tools. The $iCycler^{(R)}$ iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) generates a standard curve vs. log DNA concentration for all standards and determines the DNA concentration of unknowns by interpolation. The result showed 0.999 (L. casei,), 0.998 (L. plantarum), 0.998 (B. subtilis), 0.996 (S. bovis), 0.994 (E. coli K88+) of correlation coefficient, indicating high reliability. This result demonstrated a culture independent quantification of the intestinal microbes with known DNA sequence could be reliable analytical method based upon the accuracy and efficiency. The CT value of Bacillus subtilis in the ileum digesta of pigs fed diet supplemented antibiotics and HCl 0.1% was significantly lower than other groups. However, the CT value of Lactobacillus casei in the cecum digesta of pigs fed diet supplemented HCl 0.1% was significantly higher than other groups. It could indicate that addition of HCl 0.1% to weaning diet might increase the population of health promoting bacteria. During the whole experimental period, average daily gain (ADG) in HCl 0.1 % supplementation groups were higher (P<0.05) than other HCl supplemented groups. The level of IgA were affected by HCl 0.1%(P<0.05). From this study, supplementation of 1g/kg HCl in the diet of weaning pigs increased the population of health promoting bacteria, resulted in alleviation immune function and improvement of growth performance of weaning pigs.
From these experiments, the high PCR efficiency and correlation coefficient together with acceptable real-time PCR results indicated that the culture-independent quantitative real-time PCR method could be a reliable and efficient when quantifying the intestinal microbials. Establishment of analytical methods for other microbials that are popularly used as probiotics and that are responsible for diarrhea occurrences are needed. With this powerful analytical method, further studies to reduce diarrhea occurrences and evaluate the quality of probiotics will be accurate and efficient.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY(영문요약문) ... 9
• 목차 ... 16
• 제 1 장 연구 개발 과제의 개요 ... 24
• 제 1 절 연구 개발의 목적 및 필요성 ... 24
• 제 1 항 연구개발의 목적 ... 24
• 제 2 항 연구 개발의 필요성 ... 27
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 31
• 제 1 절 국내 연구 현황 ... 32
• 제 2 절 국외 연구 현황 ... 34
• 제 3 장 연구 개발 수행 내용 및 결과 ... 36
• 제 1 절 분자 생물학적 기법을 이용한 장내 미생물 균총의 측정 ... 36
• 제 1 항 서론 ... 36
• 제 2 항 실험 방법 및 재료 ... 37
• 제 3 항 연구 결과 및 고찰 ... 41
• 제 2 절 자돈의 장 내용물에서 Lactobacillus casei의 정량 분석 기술 개발 ... 50
• 제 1 항 서론 ... 50
• 제 2 항 실험 방법 및 재료 ... 50
• 제 3 항 연구 결과 및 고찰 ... 55
• 제 3 절 Sugar beet pulp(SBP)가 이유자돈의 성장, 혈중유리아태 질소, 설사 발생 빈도 및 장내 미생물 균총에 미치는 영향 ... 61
• 제 1 항 서론 ... 61
• 제 2 항 실험 방법 및 재료 ... 64
• 제 3 항 연구 결과 및 고찰 ... 69
• 제 4 절 Sugar beet pulp(SBP)가 영양소 이용율, 질소대사 및 면역 능력에 미치는 영향 ... 92
• 제 1 항 서론 ... 92
• 제 2 항 실험 방법 및 재료 ... 92
• 제 3 항 연구 결과 및 고찰 ... 93
• 제 5 절 무기산제가 이유자돈의 성장, 혈중유리아태 질소, 설사 발생빈도 및 장내 미생물 균총에 미치는 영향 ... 101
• 제 1 항 서론 ... 101
• 제 2 항 실험 방법 및 재료 ... 103
• 제 3 항 연구 결과 및 고찰 ... 109
• 제 6 절 무기산제가 이유자돈의 영양소 소화율 및 질소 대사에 미치는 영향 ... 142
• 제 1 항 서론 ... 142
• 제 2 항 실험 방법 및 재료 ... 142
• 제 3 항 연구 결과 및 고찰 ... 143
• 제 7 절 무기산제가 이유자돈의 면역능력에 미치는 영향 ... 148
• 제 1 항 서론 ... 148
• 제 2 항 실험 방법 및 재료 ... 148
• 제 3 항 연구 결과 및 고찰 ... 149
• 제 4 장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 154
• 제 5 장 연구 개발 결과의 활용 계획 ... 166
• 제 6 장 연구 개발 과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 169
• 제 1 절 분자생물학적 기법을 이용한 장내 미생물 균총 측정 ... 169
• 제 2 절 이유자돈 사료에 Sugar beet pulp 첨가가 성장 및 영양소 소화율, 면역 능력, 장내 미생물 균총에 미치는 영향 ... 172
• 제 3 절 이유자돈 사료에 무기산제의 첨가가 성장 및 영양소 소화율, 면역 능력, 장내 미생물 균총에 미치는 영향 ... 174
• 제 7 장 참고 문헌 ... 178
• 끝페이지 ... 191