초록 ▼

○ 연구결과
방향성 식물원료 22종을 선발한 다음 감압하의 증기증류와 액체-액체 연속 추출방법에 의해 추출물을 제조하고 각 추출물의 구성성분을 정성 및 정량분석 하였다. 확립한 in vitro simulated ischemia 모델을 이용하여 활성을 조사한 결과 7종이 선발되었고 전뇌허혈모델, 국소허혈모델 및 식이섭취 모델과 같은 동물실험을 통해 최종적으로 2종의 효과가 확인되었다. 이들 후보는 산화적 스트레스를 차단하고 세포의 성장과 분화를 조절하는 주요 신호전달계인 mitogen activated protein kinase

○ 연구결과
방향성 식물원료 22종을 선발한 다음 감압하의 증기증류와 액체-액체 연속 추출방법에 의해 추출물을 제조하고 각 추출물의 구성성분을 정성 및 정량분석 하였다. 확립한 in vitro simulated ischemia 모델을 이용하여 활성을 조사한 결과 7종이 선발되었고 전뇌허혈모델, 국소허혈모델 및 식이섭취 모델과 같은 동물실험을 통해 최종적으로 2종의 효과가 확인되었다. 이들 후보는 산화적 스트레스를 차단하고 세포의 성장과 분화를 조절하는 주요 신호전달계인 mitogen activated protein kinases 중에서 extracellular signal-regulated kinase의 활성화를 저해하거나 교세포 활성화에 관여하는 일부 염증 매개물질을 저해하는 것으로 나타났다. 식물 추출물로부터 5개의 물질을 단리한 후 구조분석을 실시한 결과 4,6,6-trimethyl-bicyclo[3.1.1]hept3-en-2-ol나 4,11,11-trimethyl-8-methylene-bicyclo(7.2.0)undec-4-ene와 같은 활성물질이 확인되었다. 또한 선별된 후보들의 효능, 추출수율과 이화학적 특성을 고려하여 배합조성과 디자인 선정을 시도하였다.

Abstract ▼

IV. Results and Recommendation
1. Screening of bioactive volatile plant extracts
We attempted to screen anti-stroke materials/extracts from domestic herb plants having protective potentials against ischemic stroke.
Twenty two herbs selected from traditional Korean prescriptions or database

IV. Results and Recommendation
1. Screening of bioactive volatile plant extracts
We attempted to screen anti-stroke materials/extracts from domestic herb plants having protective potentials against ischemic stroke.
Twenty two herbs selected from traditional Korean prescriptions or database were extracted by steam distillation under reduced pressure, followed by continuous liquid-liquid extraction. They were examined for protective potentials against ischemic brain injury using an in vitro simulated ischemia model. The human neuroblastoma cells were incubated with or without samples for 48 h and then exposed to simulated ischemia(hypoglycemia and hypoxia), followed by simulated reperfusion(reoxigenation). Among tested samples, Acori graminei Rhizoma(AGR), Chrysanthemi Flos(CF), Pini Foilium(PN), Allium victoriallis var. platyphyllum(WAD), Acanthopanacis Cortex(ESR), Vitis vinifera(VV) and (R)-allylthio-2-aminopropionic acid(SAC), a water-soluble component of WAD showed significantly high neuroprotective activities by the treatments of 10-100 μg/ml samples(p<0.05). Additionally, we found that 4,6,6-trimethylbycyclo[3.1.1]hept-3-en-2-ol (TMBH), 4,11,11-trimethyl-8-methylene-bicyclo[7.2.0]undec-4-ene (TMBU), and 4-allyl-1,2-dimethoxybenzene (ADB) have neuroprotective activity among herbal constituents isolated.
2. Action mechanism on ischemic stroke in cell model
We further investigated the neuroprotective mechanism of SAC and PN using in vitro experimental models. SAC showed the negligible protective effect against NMDA-induced neurotoxicity in the cultured cerebral cortical neuron. SAC reduced cell death up to about 20-37% from 100μM to 5mM in a dose dependent manner compared to control by 100μM H2O2.. SAC also reduced cell death up to about 30% at 10 μM as compared to control in glucose-deprived immunostimulated glial cells. On the other hand, SAC slightly block the oxidation of DCF-H to DCF induced by glucose-deprived immunostimulated glial cells. SAC and PN directly inhibited the oxidation of dihydrorhodamine-123 to rhodamine-123 by NO donor, S-nitroso-N-acetylpenicillamine in a dose-dependent manner. In glucose-deprived immuno-stimulated glial cells, SAC treatment reduced the immunoreactivity of nitrotyrosine, a marker for ONOO-. However, flow cytometry analysis showed the neuroprotective effects of SAC and PN were not attributed to their inhibition of cell cycle progression. The activity of extracellular signal-regulated kinase (ERK), one family of mitogen-activated protein kinases, was increased by oxygen-glucose deprivation in cultured cerebral cortex neurons as well as by transient middle cerebral artery occlusion in rats. We found that SAC significantly inhibited the activation of ERK, which was mimicked by the ERK inhibitors U0126.
The results indicate that SAC may exert its neuroprotective effect on cerebral ischemic insults by scavenging ONOO- as well as inhibiting the ERK signaling pathway. In contrast, PN may exert its neuroprotective effect on cerebral ischemic insults by scavenging oxidative stress as well as partly inhibiting the activation of glial cells.
3. Neuroprotective effect using in vivo ischemic model
To develope reliable in vivo global and focal cerebral ischemic models, histological evaluation methods were employed. Five-min occlusion of bilateral common carotid artery of Mongolian gerbils induced neuronal cell damages in CA1 region of hippocampi 4 days after reperfusion. Cresyl staining showed loss and shrinkage of a number of pyramidal neurons. Immunohistochemical staining showed an increased number of GFAP (glial fibrillary acidic protein, an astrocyte marker)-positive cells and its immunoreacivity. As determined by 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride and cresyl violet staining, focal cerebral ischemia by occlusion of right middle cerebral artery for 2 hrs was found to induce most severe brain damages 24 hr after reperfusion.
The neuroprotective effect of the candidate extracts on the ischemic damage was examined using an in vivo focal and global ischemia models. Among tested samples, PNW, SAC and VV were found to increase the number of surviving cells/mm of the CA1 region (P<0.01) in transient global ischemia model. In focal ischemia model, SAC and PN were effective on the reduction of infarction volume. Additionally, TMBH, TMBU and ADB isolated from herbal extracts were effective both in global and focal cerebral ischemic models.
To determine the effects of dietary SAC and TMBU on the development of stroke, salt-loaded stroke-prone spontaneously hypertensive (SHRSP) rats were fed a stroke-prone diet with or without SAC and TMBU for 4 weeks. No difference of blood pressure was observed after SAC and TMBU supplementation. In the SAC and TMBU administered groups, the onset of stroke was delayed in parallel with a decrease in the incidence and mortality. The SAC and TMBU administered groups scored better in the neurological examination than the control group. These results indicate that dietary SAC and TMBU attenuate the development of stroke in salt-loaded SHRSP rats.
4. Structural analysis of active compounds
The structure of five isolated compounds from herbal extracts were elucidated by a combination of NMR techniques including 1H NMR, 13C NMR, distortionless enhancement by polarization transfer (DEPT), heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC), correlated spectroscopy (COSY) and heteronuclear multiple bonded connectivities (HMBC). As a result, compound A and C were elucidated to be 4,6,6-trimethyl-bicyclo[3.1.1]hept3-en-2-ol and 4,11,11-trimethyl-8-methylenebicyclo(7.2.0)undec-4-ene, respectively. However, for the complete structural assignment of compound B, D and E, further purification of them were required.
5. Study on application of functional food technology
Thermal, pH and storage stabilities of SAC, TMBH and TMBU were studied for the application as functional food and/or materials. The results of pH stability indicate that SAC did not decompose in buffer solutions with pH values ranging from 1 to 14. It was found that SAC was stable at 0~80℃ range of temperature and stable for 12 weeks storage at 25℃. When TMBH and TMBU were heated at 100℃ for 60 min, TMBH was heat-stable but TMBU was not. As well, TMBH exhibited storage stability but TMBU did not. It was also observed that toxicity of SAC and PN was relatively low in single oral dose toxicity study. The lethal oral dose for SAC and PN in rat is above 2,000 mg/kg body both in male and female, suggesting low toxicity.
For applying candidates to functional food and/or materials, dosage form of candidates was considered. Concerning physicochemical characteristics of SAC and SAC-Ex and comfortableness in swallowing, the capsule formulation with a diameter of 7.3-7.6 (capsule 0′) showed to be robust. Particularly, a bad taste of SAC and SAC-Ex could be covered by capsule shell. In case of the liquid active compounds PN, TMBH and TMBU, the soft capsule or liquid dosages (drink) forms was considered to be reasonable. The liquid dosages (drink) forms for PN, TMBH and TMBU consisted of 5-10% (w/w) of sugar, 0.05-0.3% (w/w) of citric acid, 0.005-0.02% (w/w) of caramel, 0.1% (w/w) of sorbitan monostearate, 0.1-1.0% (w/w) of vitamin C, 79-94% (w/w) of purified water and 10-20 g (w/w) of active ingredients. It is recommended to include PN, TMBH and TMBU as active ingredients and soybean oil as filler in a soft gelatine capsule.
Taken together, it is likely that candidate material, SAC, PN, TMBH, TMBU and ADB could be used as a diet supplement for protecting damages induced by ischemic insult and/or stroke.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 10
• CONTENTS ... 16
• 목차 ... 21
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 25
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 25
• 1. 연구개발의 목적 ... 25
• 2. 연구개발의 필요성 ... 25
• 제 2 절 연구개발 과제의 범위 ... 26
• 제 3 절 활용방안 및 전망 ... 27
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 29
• 제 1 절 국외 기술개발 현황 ... 29
• 제 2 절 국내 기술개발 현황 ... 34
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 35
• 제 1 절 연구수행 방법 ... 35
• 1. 방향식물 추출물의 제조 및 표준화 연구 ... 35
• 가. 시료의 선발 ... 35
• 나. 각종 방향식물 추출물의 제조 ... 36
• 다. 유효지표물질의 선정과 분석 ... 36
• 2. 시험관내 모델을 이용한 활성 물질의 탐색 및 발굴 ... 37
• 가. 유사 허혈 모델(Simulated in vitro ischemia model)의 확립 ... 37
• 나. 세포생존율의 측정 ... 38
• 3. 세포모델에서 허혈성 뇌졸중 예방 작용기전 연구 ... 38
• 가. 초대세포 및 뇌신경세포주의 배양 ... 38
• 1) 교세포(astrocyte) 배양 ... 38
• 2) 대뇌피질 신경세포(cerebrocortical neuron) 배양 ... 39
• 3) C6 glioma 배양 ... 39
• 나. 허혈 조건 유도시 신경세포에 대한 시료의 보호효과 ... 39
• 1) 면역자극-포도당 결핍(immunostimulated glucose deprivation)조건에서의 신경보호효과 ... 39
• 2) 산소-포도당 결핍(oxygen-glucose deprivation, OGD)조건에서의 신경 보호효과 ... 40
• 3) 세포사 측정 ... 40
• 4) Western blot analysis ... 40
• 다. 항산화 체계조사 ... 41
• 1) MDA 함량 ... 41
• 2) 총 항산화능, 반응성 산소종(ROI) 및 질소종(RNI) 소거능 측정 ... 41
• 가) 총 항산화능(Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC) ... 41
• 나) Superoxide 라디칼 소거능 ... 42
• 다) Hydroxyl 라디칼 소거능 ... 42
• 라) Hydrogen peroxide 소거능 ... 43
• 마) Peroxynitrite 소거능 ... 43
• 바) Nitric oxide(NO) 소거능 ... 43
• 3) 면역세포화학적 염색(Immunocytochemical staining) ... 44
• 4) 교세포의 2,7-dihydrodichlorofluorescein(DCF) 형광도 측정 ... 44
• 라. 미토콘드리아 손상조사 ... 44
• 마. 염증매개 물질의 변화 조사 ... 45
• 바. 세포주기 분포(cell cycle distribution)의 측정 ... 45
• 4. 뇌허혈 동물모델을 이용한 효능 조사 ... 46
• 가. 뇌허혈 유발 동물 모델에서의 효과 조사 ... 46
• 1) 동물 ... 46
• 2) 국소허혈모델 ... 46
• 3) 전뇌 허혈 모델 ... 47
• 4) Western blot analysis ... 47
• 나. 행동양식 및 학습능의 변화 조사 ... 48
• 다. 시료의 식이 섭취에 의한 효과 조사 ... 48
• 1) 실험동물의 사육 및 실험군의 분리 ... 48
• 2) 혈압 측정 및 뇌졸중 발병빈도 관찰 ... 49
• 3) 뇌경색 면적 측정 및 조직학적 검사 ... 49
• 4) Cytokine 측정법 ... 50
• 5) 혈액지표 측정 ... 51
• 5. 활성소재의 구조분석 및 동정 ... 51
• 가. 허혈성 뇌졸중 예방 활성물질의 조분리 ... 51
• 나. 활성물질의 구조분석 및 신규성 조사 ... 52
• 6. 기능성 식품 응용기술 연구 ... 53
• 가. 선별된 추출물의 소재화를 위한 기초조사 ... 53
• 나. 허혈성 뇌졸중 예방 기능성 식품화를 위한 응용기술 연구 ... 53
• 7. 결과의 통계처리 ... 53
• 제 2 절 결과 및 고찰 ... 55
• 1. 허혈성 뇌졸중 예방 소재 탐색, 발굴 및 작용기전 조사 ... 55
• 가. 허혈성 뇌졸중 예방 식품 선도 소재 발굴 ... 55
• 1) 방향성 식물 추출물의 제조 ... 55
• 2) 방향성 식물 추출물의 표준화 ... 56
• 3) 시험관내 모델을 이용한 활성물질의 탐색 및 발굴 ... 63
• 가) 유사허혈모델(Simulated in vitro ischemia model)의 확립 ... 63
• 나) 유사 허혈 모델을 이용한 활성물질의 탐색 및 선별 ... 67
• 나. 세포모델에서 허혈성 뇌손상 예방 활성물질의 작용기전 ... 68
• 1) 세포의 독성 조사 ... 68
• 2) 항산화 체계 조사 ... 74
• 3) 염증매개 물질의 변화 조사 ... 90
• 2. 뇌허혈 동물모델을 이용한 효능 조사 ... 93
• 가. 뇌허혈 동물모델을 이용한 식품 선도 소재 발굴 및 생체내 효과 조사 ... 93
• 1) 뇌허혈 유발 및 유발에 따른 신경 및 혈관 독성 조사 ... 93
• 2) 후보 추출물 및 물질의 조사 ... 97
• 나. 뇌허혈동물 모델을 이용한 허혈성 뇌졸중 예방효과 확인 ... 102
• 1) 전뇌허혈모델과 국소허혈모델을 이용한 효과 확인 ... 102
• 2) 뇌의산화적 손상정도 및 염증매개물질의 변화 측정 ... 103
• 3) 행동양식 및 학습능의 조사 ... 103
• 다. 활성물질의 식이섭취를 통한 허혈성 뇌졸중 예방 효과 ... 114
• 3. 활성소재의 구조분석 및 동정 ... 124
• 가. 허혈성 뇌졸중 예방 활성물질의 조분리 ... 124
• 나. 활성물질의 구조분석 및 신규성 조사 ... 125
• 4. 기능성식품 응용기술 연구 ... 141
• 가. 허혈성 뇌졸중 예방 활성물질 소재화를 위한 기초조사 ... 141
• 나. 허혈성 뇌졸중 예방 기능성 식품화를 위한 응용기술 연구 ... 152
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 154
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 156
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 157
• 제 7 장 참고문헌 ... 163
• 끝페이지 ... 174