초록 ▼

○ 연구결과
1. 파밤나방 인공사료 개량 및 사육조건 개선
생물적 방제 능력이 우수한 파밤나방 핵다각체병바이러스를 사용하기 위하여 그 숙주 곤충인 파밤나방을 대량 사육할 수 있는 기존의 인공사료의 주성분 및 미량성분을 더 값싸고 실용적으로 개선하여 사육단가를 절반 수준으로 낮추어 사업화가 가능하게 되었고, 바이러스를 대량 증식 하기 위한 대량사육을 하기 위한 용기별 적정 사육량을 결정하였다. 파밤나방의 사육 최적조건을 찾기 위해서 온도, 습도 등의 조건을 구명하여 앞으로 파밤나방을 사육하여 다른 연구를 수행할 연구자들에게

○ 연구결과
1. 파밤나방 인공사료 개량 및 사육조건 개선
생물적 방제 능력이 우수한 파밤나방 핵다각체병바이러스를 사용하기 위하여 그 숙주 곤충인 파밤나방을 대량 사육할 수 있는 기존의 인공사료의 주성분 및 미량성분을 더 값싸고 실용적으로 개선하여 사육단가를 절반 수준으로 낮추어 사업화가 가능하게 되었고, 바이러스를 대량 증식 하기 위한 대량사육을 하기 위한 용기별 적정 사육량을 결정하였다. 파밤나방의 사육 최적조건을 찾기 위해서 온도, 습도 등의 조건을 구명하여 앞으로 파밤나방을 사육하여 다른 연구를 수행할 연구자들에게 중요한 자료로 이용할 수 있게 하였다.
2. 핵다가체병바이러스 생화학적 특성 검정
우리나라에 분포하는 파밤나방 핵다각체병바이러스의 병원성이 동일한지를 파악하기 위하여 전자 현미경과 당밀도 구배법 등의 기술을 이용 생화학적 특성을 검정하였으며 기주 곤충과 병원균과의 감염기작, 병원성의 발현 등 상호관계를 구명하기 위해서 곤충의 방어체계에 대한 연구로 SeBPV가 파밤나방에 침입한 후 과발현되는 IAP, Serpin 그리고 SOCS5 유전자에 관하여 기초적인 연구를 수행하였다.
또한 친환경을 위한 생물적 방제 인자인 곤충바이러스를 6종을 수집 및 분리하여 보관 중이다.
3. 핵다각체병바이러스의 대량 생산체계 구축
핵다각체병바이러스 대량생산에는 기주 생체 증식하는 바이러스 특성 때문에 기주곤충을 이용한 대량 증식법이 이용되고 있다. 이에 맞는 최적 생산조건을 구명하기 위하여 핵다각체병바이러스 접종농도, 유충영기, 온도 조건 등을 조사하여 28℃조건에서 3령에 1.0x10⁵ PIBs/ml을 접종 했을 때 바이러스의 생산량이 가장 많았다. 기주식물에서 바이러스 안정성에는 문제가 없어 TDmau 바이러스를 60℃에서 20분 이상을 가열했을 때 약 20%정도의 병원성이 감소하였으나 70℃ 이상의 고온에서는 10분 이상 가열했을 때 병원성이 50% 이상 감소하였고 100℃에서는 병원성을 완전히 상실하였다. 50℃ 이하에서는 8시간 처리했을 때 바이러스 활동에는 크게 영향을 미치지 않아TEk. -20℃에 동결 보관에서 6개월 이상 병원성이 지속되었으며 -5℃에서는 90일 정도 병원성 활성이 유지되었다. 그러나 5℃ 이상에서는 75일 이후부터 병원성이 EJfdjwuT다.
온실, 비닐하우스, 노지에서 태양광선에 방치 후 일별로 잎을 채취하여 2령 유충에 먹이로 공급한 결과 온실과 비닐하우스에서는 5일째부터 잎의 앞면 살포에서 병원성이 상실되기 시작하였으나 잎의 뒷면과 기주식물 전체에 살포한 것은 9일째부터 병원성이 상실되었다. 그러나 노지 포장에서는 앞면 살포는 2일부터 병원성이 저하되기 시작하여 15일째에 병원성이 상실되엇다. 뒷면과 전체 처리에서는 불활성화가 약간 늦게 나타났지만 온실, 비닐하우스보다는 병원성이 빨리 상실되었다.
파밤나방을 대상으로 유묘와 포장에서 이용 가능성을 검정하여 노지와 비닐하우스에서 107다 각체/ml 이상을 살포농도로 결정하였으며, 살포기는 입자가 고른 무인방제기가 동력방제기보다 살충 효과가 뚜어남을 확인하여 농업인이나 제조 회사가 바이러스를 안전하게 사용하고 제조할 수 있게 하였다.
4. 핵다각체병바이러스 생화학적 특성 검정
Baculovirus subgroup A에 속하는 파밤나방 핵다각체병바이러스(Spodoptera exiguanucleopolyhedro virus : SeNPB)는 circular double stranded DNA를 갖는 봉상의 바이럿, 다각체 단백질 내에 바이러스 입자가 매립되어 있다. 생화학적 특성 검정은 다각체 및 비리온 단백질 전기영동, 바이러스 DNA의 제한효소 분석하였다. 또한 SeNPV가 파밤나방에 침입한 후 과발현되는 IAP, Serpin, 그리고 SOCS을 연구하였으며 핵다각체병바이러스 병원성 검정을 유묘 및 포장 검정을 실시하여 효과를 살충효과를 판정하였다.
5. 핵다각체병바이러스 제형화
핵다각체병바이러스를 제형화하고 안정성을 검정하기 위하여 환경안전성 기초어독시험, 수서 행물에 대한 독성, 경구, 경피 처리에 따른 병원성을 검정하고 독성시험으로 안막 자극, 변이원성을 실시하여 안전성을 확보하였다. 제형의 기본과정으로 부자재 종류별 제형화, 상품화를 위한 제형, 제형화를 위한 첨가제 선발, 약효증진용 보조제를 탐색하여 환경친화형 제형화 기술 확립하였다. 또한 유효성분 분석법을확립하기 위하여 온도별 학대시험, QC확립을 위한 생물검정을하였다. 생산 가능성의 증명을 위해 실험실 규모의 제조방법 확립, 제품 생산담당자와 공동으로 pilot test 실시, 포장시험 및 제조허가용 시제품 제조, 생산 공정의 문제점을 분석하여 해결하였고 제품동록을 위한 시험 추진하여 팜가드란 상표명으로 미생물농약 등록 시험 중이다.

Abstract ▼

Ⅱ. Research content and scope
RESULTS AND DISCUSSION
1. Mass rearing condition of Spodoptera exigua in vivo
Nucleopolyhedrovirus(NPV) is a well-known entomopathogenic virus. In an attempt to develope it as a potential biocontrol agent in Korea, we have studied rearing condition of S. exigua

Ⅱ. Research content and scope
RESULTS AND DISCUSSION
1. Mass rearing condition of Spodoptera exigua in vivo
Nucleopolyhedrovirus(NPV) is a well-known entomopathogenic virus. In an attempt to develope it as a potential biocontrol agent in Korea, we have studied rearing condition of S. exigua.
The rearing of S. exigua larvae on three different artificial diet was tested under the various conditions such as major food constituents, vitamins, temperature, humidity and rearing cage size. This study showed that yellow soybean powder was working well as an alternative major nutrients constituents. Vitamins seem to play a critical role to complete the life cycle of S. exigua. As temperature goes higher from 20℃ to 32℃, the larval weight of S. exigua was gradually increased. In addition, optimal humidity was 60% at 28℃. The optimal ratio between rearing cage and number of larva was turned out to be as follows; 31×25×19㎝/250∼00, 27×20×14㎝/150∼00, 7×12.5×6㎝/100∼50.
2. Larval growth of S. exigua by different artificial diet
Compared to standard artificial diet, artificial diet 1 was better in producing total number of eggs per female. However, it was quite similar in number of egg masses laid per female, hatchability, developmental periods between artificial diet 1 and 2. Using these larva produced from rearing conditions, it was possible to mass produce SeNPV.
3. Optimal production condition of SeNPV on S. exigua larva
SeNPV extracts was isolated using 55% sucrose gradients and centrifugation method. Optimal conditions for SeNPV concentrations on the life cycle of S. exigua at various temperature such as 20℃, 24℃, 28℃, and 32℃. Also, the overall growth of the larvae infected with SeNPV was estimated by RGRi, RCRi, and ECD.
4. Yields of SeNPV by different temperature and S. exigua larval stage
The larval mortality was examined using 2nd to 4th instar larvae at both 20℃ and 28℃ by applying various concentration of SeNPV on artificial diet. We found out that the individual mortality was increased SeNPV concentration goes up and the production of SeNPV was best under the condition; 28℃, 3rd instar larva, and 1.0×10⁵ PIBs/㎖ Furthermore, the same conditions were applied to the mass rearing of S. exigua larvae in the cage(31×25×19cm). Taken together, we have established both stable rearing
condition of S. exigua, and mass production for SeNPV.
5. The Effect of Temperature, Storage and Sunlight on the Pathogenicity of the S. exigua nucleopolyhedrovirus A nucleopolyhedrovirus of the beet armyworm, Spodoptera exigua would be a promisible agent for the control of the insect.
To develop a viral insecticide using S. exigua NPV, effect of spray on temperature, storage and sunlight on the pathogenicity of the virus were studies as follows. Stability of S. exigua NPV was quickly decreased at the higher temperature than 60℃ and at the longer exposure to the higher temperature. Storage of the virus at -20℃ was kept higher pathogenicity after 6 months. Viral activity was maintained more than 9 days on the sprayed entire, under of leaves in green house and PVC house, but decreased at 2 days after spray in the leaf surface when exposed the virus to sunlight
6. Selection of spray method and sprayer of SeNPV
We have investigated to find optimal sprayer on kidney bean seedling and chrysanthemum. On the kidney bean, mortality of S. exigua by hand and delivery sprayer were higher than that by electronic sprayer. Electronic sprayer was high mortality at 3 days after treatment but SeNPV did not spread out to leaf surface so the mortality was low at 7 days after treatment.
In automatic sprayer mortality was 92.2% at SeNPV 1×10⁸PIBs/㎖as 5% higher than other sprayer. It could feed easy by S. exigua cause of SeNPV spread out all leaves surface.
7. Stability and pathogenicity of SeNPV formulation
Formulations of SeNPV were additive matters to increase mortality.
Kaoline and bentonite affect mortality of S. exigua larva. It suggested that these mineral materials indigest on the midgut of S. exigua. Presample made 7 times and among them, water dispersible granule(WG) was suggestion to production. On the experiment to increase and long time residue of SeNPV on the plant, fluorescent brightener which induced stilbene disulfonic acid was highest mortality as 97%.
8. Biochemical characteristics of SeNPV
Nucleopolyhedrovirus collected and conserved 6 species on lepidopteran.
Polyhedron and virus particles appeared on the infected tissue which is corpulent nuclear compared to normal tissue. The shape of polyhedron was quadrangle and octagon in the electron microscope. Various virus particles was found in the polyhedron and a number of nucleocapsid within a envelop embeded. The number of virion band waas nine and virion band showed six clear.
9. Effects of different temperatures on pathogenicity of Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus(SeNPV)
This experiment was conducted to investigate pathogenicity of Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus(SeNPV) with different temperatures for mass production. In laboratory condition, LC₅₀ values of SeNPV were 9.797×10³ PIBs/㎖at 20℃ and 3.351×10² PIBs/㎖at 32℃ in 2nd instar larvae.
LC₅₀ of the other larval stage were similar to that of 2nd instar. LT₅₀ values of SeNPV was 9.0 days in 1.0×10³ PIBs/㎖but 6.9 to 3.5 days in 1.0×10⁴∼PIBs/㎖against 3rd instar of Spodoptera exigua. LT₅₀ Values of 1.0×10⁴ PIBs/㎖were 5.7, 5.5 and 4.9 days in 24, 28 and 32℃, respectively. As a
results, LT₅₀ was shortened with increase of temperatures up to 32℃ and also dependent on viral concentration and larval instars.
10. Field experiment and enhanced effectiveness of SeNPV with additives Values of lethal tim(LT₅₀) of S. exigua treated SeNPV after 7 days treatment on the kidney bean seedling in open field and PVC house were 5.96 days on 1×10⁶ PIBs/㎖ 4.91 days on 1×108 PIBs/㎖in the open field and 5.84 days on 1×10⁶ PIBs/㎖ 4.86 days 1×10⁸ PIBs/㎖ Lethal time was gradually short on the high concentration of SeNPV. Cumulative mortality of S. exigua after spray of SeNPV on the kidney bean seedling in the greenhouse increased fast 4 days after spray on the concentration of 1×10⁷, 10⁸ PIBs/㎖ｼ such as 90% mortality after 10 days. On the concentration of 1×10⁶ PIBs/㎖ the mortality of S. exigua was low which is not suggestion concentration.
Values of lethal tim(LT₅₀) of S. exigua treated SeNPV on the chrysanthemum in open field and PVC house were 7.1 and 6.5 days on 1×10⁸PIBs/㎖ respectively. Protection value of S. exigua after spray of SeNPV 1×10⁸PIBs/㎖ｼ on the chrysanthemum in the open field and PVC house were 92.3%. Values
of lethal tim(LT₅₀) of S. exigua treated SeNPV with Tinopal-UNPA-GX and Fluostain on artificial diet were 4.39 and 4.25 days, respectively.
11. Cloning and partial characterization of SeIAP, SeSerpin and SeSOCS genes overexpressed after SeNPV infection Insect innate immunity has been one of the hot issues in conjunction with host-pathogen interactions. Our laboratory has recently been involved in investigating the interactions between S. exigua and SeNPV. Thus, we have cloned and partially characterized serpin and suppressor of cytokine signaling (SOCS) from S. exigua and inhibitor of apoptosis (IAP) from SeNPV. It has beeen known that IAP play a critical role in the early phase after SeNPV invasion. In order to estimate the level of IAP-2 and IAP-3 transcripts, RT-PCR analysis was conducted. It showed that these genes were specifically induced in response to SeNPV. The level of IAP-3 was higher than that of IAP-2. In addition, IAP-2 was cloned into pRSET expression vector to produce the recombinant protein and polyclonal antibody against it.
Recent report on serpin from Anopheles gambiae indicates that the level of serpin was also induced in the midgut at the time of Plasmodium invasion.
This lead us to clone and characterize the homologous serpin gene that may have important functions in response to pathogens from S. exigua. Using the RT-PCR and TA cloning approach, we found a partial fragment (514 bp) of serpin from S. exigua. It has a homology to various insects such as Bombyx mori (67%), Manduca sexta (52%), Anopheles gambiae (42%), and Drosophila melanogaster (41%). Temporal expression patterns of SeSerpin were examined using RT-PCR after being immune-challenged with SeNPV and laminarin. It showed that SeSerpin was strongly upregulated by SeNPV and laminarin.
Suppressor of cytokine signaling (SOCS) is known to play a key role in the insect defense system. SOCS has been characterized as a negative feedback regulator in JAK-STAT signaling cascade involved in NOS production. This context lead us to clone and characterize a SOCS gene that may have important functions in response to pathogens. Using the RT-PCR and TA cloning approach, we found a partial fragment (416bp) of SOCS5 from S. exigua. Blast search and multiple alignment data showed that it has a homology to various insects such as Anopheles gambiae (78%), Aedes aegypti (75%), Drosophila Melanogastar (77%), Mus musculus (69%), and Homo sapiens (69%). Temporal induction patterns of SeSOCS5 were analysed after being immune-challenged with NPV and laminarin. It showed that the level of SeSOCS5 mRNA was strongly induced in response to SeNPV and laminarin, respectively. Future work will be focused on the cellular distribution of SeNPV-IAP, SeSerpin, and SeSOCS5 in the NPV-invaded cells using confocal microscopy and the polyclonal antibodies against the three genes, respectively.
12. Formulation of SeNPV
Formulation for SeNPV could make suspension concentrate in liquid and water dispersible granular in solid which with high mortality on S. exigua.
We selected additives to enhance effectiveness of SeNPV and could establish on water dispersible granular. To evaluate of environmental safety, we research toxic of humans and animals and toxic of environmental ecology on the suspension concentrate and water dispersible granular. The results were third degree of fish virulence which could make production.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• Summary ... 8
• CONTENTS ... 15
• 목차 ... 19
• 제1장 연구과제의 개요 ... 23
• 제1절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 24
• 1. 연구개발의 목적 ... 24
• 2. 연구개발의 필요성 ... 25
• 제2절 연구개발의 목표 및 내용 ... 27
• 1. 연구개발 목표 ... 27
• 2. 연구의 내용 및 범위 ... 29
• 3. 연구개발 추진 체계 ... 32
• 제2장 국내외 기술 개발 현황 ... 33
• 제1절 국내기술 현황 ... 34
• 제2절 국외기술 현황 ... 35
• 제3절 앞으로 전망 ... 36
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 37
• 제1절 파밤나방의 대량 사육조건 구명 ... 38
• 1. 서언 ... 38
• 2. 재료 및 방법 ... 38
• 3. 결과 및 고찰 ... 40
• 제2절 인공사료 조성별 파밤나방 유충 생육 ... 46
• 1. 서언 ... 46
• 2. 재료 및 방법 ... 46
• 3. 결과 및 고찰 ... 47
• 제3절 파밤나방 핵다각체병바이러스 최적 생산조건 구명 ... 51
• 1. 서언 ... 51
• 2. 재료 및 방법 ... 51
• 3. 결과 및 고찰 ... 53
• 제4절 온도 및 영기에 따른 파밤나방 핵다각체병바이러스의 수량 ... 59
• 1. 서언 ... 59
• 2. 재료 및 방법 ... 59
• 3. 결과 및 고찰 ... 61
• 제5절 온도, 저장조건 및 태양광선이 파밤나방핵다각체 병바이러스 활성에 미치는 영향 ... 66
• 1. 서언 ... 66
• 2. 재료 및 방법 ... 66
• 3. 결과 및 고찰 ... 68
• 4. 결과 요약 ... 73
• 제6절 파밤나방 핵다각체병바이러스 바이러스 살포방법 구명 ... 75
• 1. 서언 ... 75
• 2. 재료 및 방법 ... 75
• 3. 결과 및 고찰 ... 78
• 제7절 핵다각체병바이러스의 제형의 안정성 및 효과 검정 ... 81
• 1. 서언 ... 81
• 2. 재료 및 방법 ... 81
• 3. 결과 및 고찰 ... 83
• 제8절 핵다각체병바이러스의 생화학적 특성 검정 ... 88
• 1. 서언 ... 88
• 2. 재료 및 방법 ... 88
• 3. 결과 및 고찰 ... 91
• 제9절 온도조건에 따른 파밤나방핵다각체병바이러스 (SeNPV)의 병원 활성 ... 99
• 1. 서언 ... 99
• 2. 재료 및 방법 ... 99
• 3. 결과 및 고찰 ... 101
• 제10절 핵다각체병바이러스 포장 검정 및 살포효과 증진 물질 선발 ... 108
• 1. 서언 ... 108
• 2. 재료 및 방법 ... 109
• 3. 결과 및 고찰 ... 111
• 제11절 SeNPV가 파밤나방(Spodoptera exigua)에 감염된 후 과발현된 IAP, Serpin, 과 SOCS 유전자에 관한 연구 ... 118
• 1. 서언 ... 118
• 2. 재료 및 방법 ... 118
• 3. 결과 및 고찰 ... 120
• 4. 결과 요약 ... 128
• 제12절 파밤나방 핵다각체병바이러스 제형화 ... 130
• 1. 서언 ... 130
• 2. 재료 및 방법 ... 130
• 3. 결과 및 고찰 ... 145
• 4. 결과 요약 ... 171
• 제4장 목표달성도와 관련분야에서의 기여도 ... 173
• 제1절 목표 달성도 ... 174
• 1. 제 1 차년도의 연구개발 목표와 평가의 착안점 및 달성도 ... 174
• 2. 제 2 차년도의 연구개발 목표와 평가의 착안점 및 달성도 ... 175
• 3. 제 3 차년도의 연구개발 목표와 평가의 착안점 및 달성도 ... 176
• 4. 최종 평가의 착안점 및 목표 달성도 ... 176
• 제2절 관련 분야에의 기여도 ... 177
• 1. 기술적 측면에서의 기여도 ... 178
• 2. 학문 발전에의 기여도 ... 178
• 3. 경제, 산업적 측면에의 기여도 ... 180
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 181
• 제1절 추가연구의 필요성 ... 182
• 1. 곤충 바이러스의 다른 해충으로 추가 연구의 필요성 ... 182
• 2. 포장 및 타 작물로의 확대의 필요성 ... 182
• 제2절 기업화 추진방향 ... 182
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 183
• 제1절 미국 농무성 곤충 생물적 방제연구소 ... 184
• 1. 출장개요 ... 184
• 2. 출장수행 사항 ... 185
• 3. 만난 사람들 ... 189
• 제7장 참고문헌 ... 190
• 끝페이지 ... 204