Abstract ▼

Probiotics is a promising alternative to subtherapeutic use of antibiotics for swine feed and may be part of the solution for decreasing or eliminating antibiotic use in animal agriculture. The aim of this study to isolate potential probiotic Lactobacillus strains from piglet feces and to construct

Probiotics is a promising alternative to subtherapeutic use of antibiotics for swine feed and may be part of the solution for decreasing or eliminating antibiotic use in animal agriculture. The aim of this study to isolate potential probiotic Lactobacillus strains from piglet feces and to construct recombinant Lactobacillus
strain producing FaeG antigen on the cell surface.
Four hundreds strains of Lactobacillus were isolated from fecal samples of 120 piglets which were raised at six different farms located in 4 different areas of Gyeongsangnam-do. Of these strains, eight strains selected for their resistance to low pH and higher bile acid in primary screening procedure were identified and further studied on their probiotic properties.
When the strains were identified biochemically by using API CHL Kit, GSF3 was classified as L. plantarum with 78.3% confidence and other isolates 6-4, GJO2, GSD1, SMP2, SJD2, HD11-1 and SJG1 were L. fermentum with more than 90% confidence. But all of the eight selected strains were identified as L. reuteri by PCR identification using species-specific primer pair Lreu/Lrue4.
The eight Lactobacillus reuteri strains all maintained their viability during incubation at pH 2.0 for 3 h and the strains 6-4, GSF3, GSD1, HD11-1 survived at pH 1.0 for up to 1 h when grown in the pH-adjusted MRS broth. All strains survived but incubated in MRS broth containing 5% bile salt. The strains all expressed higher bile salt hydrolase (BSH) activity than the commercial strains L. reuteri Avibro2.
The eight strains were examined for their susceptibility to 11 antibiotics using a liquid medium dilution technique for minimal inhibitory concentration (MIC). The results have shown that the level of susceptibility to the antibiotics is strain-dependent. All strains except GSD1 were resistance to vancomycin. SMP2, SJD2, HD11-1, and SJG1 had an MIC value of >256 μg/ml for erythromycin.
All of the eight strains inhibited six strains of pathogenic bacteria (Salmonella typhimurium, S. enteritidis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, E. coli K88) when determined by the agar spot test. But sterilized spent culture supernatant (SSCS) of the eight isolates did not inhibit the growth of six pathogens..
Strains 6-4 and GSF3 were more adhesive when the eight isolates were examined for adhesion using Caco-2 cell culture. Sterilized supernatant fluid from cell suspension (SSCS) of 6-4 and HD11-1 significantly affected the adhesion. 6-4 and GJO2 showed strong antiadhesion activity against L. monocytogenes and Bacillus cereus.,
Strain 6-4 was administered through the feed to weanling piglets. for 17 days.
The liveweight gains and feed consumption of piglets were recorded daily.
Lactobacilli and enterobacteria cell counts were determined in the fecal samples.
Strain 6-4 did not enhance liveweight gains and feed conversion rates in piglets.
There were no big differences in lactobacilli and enterobacteria cell counts in the fecal sample between control and treatment group.
CluA is a 136 kD surface-bound protein encoded by plasmid pDA11 of Lactococcus lactis and is associated with cell aggregation linked to high-frequency transfer of the plasmid in conjugation. CluA gene (cluA) is preceded by a promoter and a consensus ribosome binding site. The signal sequence (40 aa) coding region and the structural gene, is followed by a translational stop codon and a transcription terminator. A secretion and anchoring cassette with the promoter, signal sequence, anchoring hexapeptide and transcription terminator of cluA was constructed using PCR.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY(영문요약문) ... 6
• CONTENTS(영 문 목 차) ... 8
• 목 차 ... 9
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 12
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 범위 ... 12
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 12
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 14
• 제 1 절 생균제용 Lactobacilus의 분리 ... 14
• 제 2 절 항원발현 유산균 개발 ... 16
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19
• 제 1 절 이론적, 실험적 접근방법 ... 19
• 1. 자돈의 분변에서 Lactobacillus의 분리와 특성조사 ... 19
• 가. 분리 균주의 선별 ... 19
• 나. 1차 선발 균주의 특성 ... 20
• 다. 최종 선발 균주의 특성 ... 23
• 1) 분리 균주의 동정 ... 23
• 2) 생균제 특성조사 ... 23
• 가) 산성 pH에서 생장 ... 23
• 나) 담즙산에서의 생장 ... 23
• 다) 병원성 미생물에 대한 항균활성 ... 23
• 라) 부착성과 부착 억제성 ... 24
• 라. L. reuteri 6-4의 사양실험 ... 27
• 2. 항원발현 유산균 개발 ... 29
• 가. 세포응집단백질 영역의 최소화 ... 29
• 나. Lactobacillus 유래 플라스미드의 염기서열결정 ... 29
• 다. Cloning, transformation 및 DNA manipulation ... 29
• 라. β-lactamase (Bla) gene fusion ... 30
• 마. FaeG 발현벡터의 작성 ... 30
• 제 2 절 연구결과 ... 32
• 1. 자돈의 분변에서 Lactobacillus 균주의 분리와 특성조사 ... 32
• 가. Lactobacillus의 분리 ... 32
• 나. 1차 선발된 Lactobacillus균주의 성질 ... 34
• 다. 최종선발 균주의 동정과 생균제 특성 ... 45
• 1) 선발된 균주의 산 및 담즙산 내성 ... 45
• 2) 최종선발 균주의 동정 ... 48
• 가) API 50 CHL kit에 의한 동정 ... 48
• 나) 16S-23S rRNA ISR-PCR에 의한 동정 ... 48
• 3) 최종 선발 균주의 생균제 특성 ... 54
• 가) 산성 pH와 담즙산에서의 생장 ... 54
• 나) Bile salt hydrolase (BSH)의 활성 ... 60
• 다) 병원성 미생물에 대한 항균활성 ... 62
• 라) CaCo-2 세포에 대한 부착성 ... 66
• 마) Caco-2 세포에 대한 부착 억제성 ... 70
• 4) L. reuteri 6-4의 사양실험 ... 75
• 가) 증체량, 사료섭취량 및 사료요구율 ... 75
• 나) 분내 미생물의 변화 ... 75
• 2. 항원 발현 유산균 개발 ... 77
• 가. Lactobacillus 유래 플라스미드의 염기서열분석 ... 77
• 나. 세포응집단백질유전자 (clu4)영역의 최소화 ... 77
• 다. Northern blot에 의한 전사체 분석 ... 79
• 라. FaeG 항원발현벡터의 구축 ... 81
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 85
• 제 1 절 자돈의 분변에서 Lactobacillus 균주의 분리와 특성조사 ... 85
• 제 2 절 항원 발현 유산균 개발 ... 86
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 87
• 제 1 절 추가연구의 필요성 ... 87
• 제 2 절 타연구에의 응용 ... 87
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 88
• 제 7 장 참고문헌 ... 90
• 끝페이지 ... 95