초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발결과
H. parasuis 감염증은 돼지에서 섬유소성 복막염, 관절염을 동반한 급성 다발성 장막염 (일명 Glässer씨 병) 을 일으키는 질병이다. 최근 연구에 의하면, H. parasuis는 15 개의 혈청형 (serovars) 과 비정형 (non typeable strain) 으로 나뉘어져 있고, 유행하고 있는 혈청형의 분포도 발생 지역에 따라 다르게 나타나고 있다.
본 연구는 국내에서 발생하는 H. parasuis infection을 체계적으로 파악하기 위

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발결과
H. parasuis 감염증은 돼지에서 섬유소성 복막염, 관절염을 동반한 급성 다발성 장막염 (일명 Glässer씨 병) 을 일으키는 질병이다. 최근 연구에 의하면, H. parasuis는 15 개의 혈청형 (serovars) 과 비정형 (non typeable strain) 으로 나뉘어져 있고, 유행하고 있는 혈청형의 분포도 발생 지역에 따라 다르게 나타나고 있다.
본 연구는 국내에서 발생하는 H. parasuis infection을 체계적으로 파악하기 위하여 H. parasuis 감염증의 임상병리학적 소견을 나타내는 돼지에서 분리한 H. parasuis를 대상으로 DNA profile, 세포외막 단백질 (OMP) pattern 조사 및 항생제 감수성 시험을 실시하였다.
본 연구에서 15 주의 표준 균주와 50 주의 H. parasuis 국내 분리주를 대상으로 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 을 실시한 결과 모든 균주에서 821 bp의 PCR 산물이 생성되어 양성임을 나타내었다. 제한효소 Hind III와 Hinf I에 의한 821 bp PCR 산물의 절단유무에 따라 I, II, III 및 IV 등의 4가지 PCR-RFLP type으로 분류할 수 있는데, 50 주의 국내 분리주의 경우 각각 5.7%, 5.7%, 25.7% 및 62.9%로 분류되었으며, 특히 5 형과 12 형이 속한 IV형이 가장 많았다.
국내 분리주의 genotype을 확인하기 위해 ERIC-PCR을 실시한 결과, 50 개의 분리주는 30 가지 유형으로 분류되어 국내에 매우 다양한 유전자형이 존재하는 것을 알 수 있었다.
병원성 인자의 한 가지 요소로 추정되는 OMP profile을 SDS-PAGE로 분석한 결과 2 가지 주요 band의 크기에 따라 국내 분리주를 2 가지 OMP profile로 분류할 수 있었으며 국내 분리주 모두 단순한 OMP profile을 나타내는 것으로 보아 강병원성을 지닌 것으로 판단되었다.
항생제 감수성 검사에서는 대부분의 분리주에서 cephalothin과 linco-spectin에 높은 감수성을 보였으며, trimethoprim-sulfamethoxazole, erythromycin 및 tetracycline에는 저항성을 나타냈다.
본 연구를 통하여 얻어진 결과는 최근 국내에서 발생되고 있는 H. parasuis infection의 역학 연구, 치료 및 예방에 효과적이고 중요한 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
H. parasuis는 한천 겔 침강반응 (AGP)에 의해 1∼15 까지 15가지의 혈청형과 nontypable strain으로 분류되고 각 혈청형간의 교차 방어능은 매우 다르며 전세계적으로 non typeable분리주의 분포가 매우 높게 나타나고 있다. 본 연구에서는 50주의 야외분리주 가운데 25주의 분리주에 대해서 혈청형 조사한 결과 48%인 12주가 non typeable strain으로 가장 높은 분포를 차지하고 있었다.
16S rRNA의 염기서열을 혈청형별로 분석하기 위해 PCR에 의해 1,475 bp의 유전자를 증폭한 후 pGEM-T easy vector에 클로닝한 후 염기서열을 RFLP 분석한 결과 200 bp부근과 800-900 bp부근에서 가장 높게 상이한 서열을 보이는 것이 관찰되었다. 향후 정밀한 분석을 통해 혈청형별로 분리할 수 있는 제한효소를 선발하여 제한효소 절편 다형성(RFLP)에 의해 혈청형 구별을 할 수 있는 방법을 개발하여야 하겠다.
H. parasuis의 구성 단백질 중 실제 면역원성이 있는 단백질을 조사하기 위하여 우선 H. parasuis 총 단백질과 OMP를 분리한 후 SDS-PAGE를 실시하고 Coomassie blue 염색을 실시하여 단백질 밴드를 조사하였다. 또한 동일한 표준주와 분리주를 대상으로 글래써씨 병에 감염되어 회복된 혈청을 이용하여 Western hybridization을 실시한 결과 31∼45 kDa 사이의 두 개의 밴드가 혈청형에 괸계 없이 두드러지게 반응하는 것을 알 수 있었다. 이는 OMP를 대상으로 한 immunoblot에서도 동일한 결과를 나타내어 OMP가 혈청형에 관계없이 중요한 면역원성으로 작용함을 알 수 있었으며 OMP가 H. parasuis의 방어에 역할을 하는지는 추후 연구가 필요하리라 사료된다.
H. parasuis는 다양한 혈청형을 가지고 있고 각 혈청형 간의 교차 방어가 잘 일어나지 않는 것으로 보고되고 있으며 따라서 자가 백신의 효과를 관찰하고자 경기도 지역의 두 농장에서 분리 확인된 균주를 NAD가 포함된 TSB에서 증식한 후 0.3% formalin으로 48시간 불활화 시키고 aluminum으로 흡착시켜 자가 백신을 만든 후 3주령에 1차로 5주령에 2차로 두당 각각 2㎖씩 근육으로 접종하였다. 백신에 의한 항체 형성을 조사하기 위해 백신 접종 전, 1차 접종 후 1주 뒤, 2차 접종 후 3주 뒤에 각각 채혈하여 ELISA 방법으로 흡광도를 측정하여 항체형성 유무를 조사하였다. 1차 접종 후 1주일 뒤의 역가는 0.7을 보이는 반면에 2차 접종 후 3주 뒤에 역가는 1.9로 매우 높게 나타남을 알 수 있었다. 백신을 접종하지 않은 경우 감염이 될 수 있는 항체가를 0.4로 보았을 때 일차 접종 보다는 따라서 일반적으로 야외 감염에 방어하기 위해서는 2차 접종이 필요하다고 사료된다.
2. 연구결과 활용에 대한 건의
돼지 다발성 장막염은 국내에서 뿐만 아니라 국외에서의 발생빈도도 높고 큰 피해를 주는 질병이므로 본 개발과제를 통해 개발된 제품이 조속히 품목허가를 취득할 수 있도록 추진하고자 한다. 이에 국내에서의 품목허가 취득이나 국외로의 수출시 국내 기관의 허가 사항이나 국검 성적 등을 요구하는 경우도 있으므로 이 때 정부의 다각적인 지원이 필요할 것으로 사료된다.

Abstract ▼

Ⅳ. RESULTS AND SUGGESTIONS
1. Results
H. parasuis is the causative agent of Glässer's disease in swine, which is characterized by acute polyserositis and polyarthritis.
According to recent studies, H. parasuis is divided into fifteen serovars and non-typable strains and the prevalent serova

Ⅳ. RESULTS AND SUGGESTIONS
1. Results
H. parasuis is the causative agent of Glässer's disease in swine, which is characterized by acute polyserositis and polyarthritis.
According to recent studies, H. parasuis is divided into fifteen serovars and non-typable strains and the prevalent serovars were different by the outbreak areas.
In order to characterize H. parasuis isolates in Korea, H. parasuis isolates recovered from field outbreaks were analyzed for genotyping and outer membrane proteins (OMPs) and antibiotics susceptibility.
Polymerase chain reaction (PCR) for an amplification of 16S rRNA gene of H. parasuis was performed with 15 reference strains and 50 H. parasuis isolates and an 821bp product was detected in all reference strains and all isolates. The 821bp PCR product from the 15 reference strains were divided into 4 PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) types (I, II, III and IV) based on the digestion patterns by Hind III and Hinf I restriction enzymes. Thirty five isolates were also classified as 4 PCR-RFLP types; I (5.7%), II (5.7%), III (25.7%) and IV (62.9%), respectively. The PCR-RFLP type IV which included serovars 5 and 12 were prevalent.
The 50 H. parasuis isolates were also typed by enterobacterial repetitive intergenic consensus ERIC-PCR and total 30 patterns were distinguished by the ERIC-PCR. The ERIC-PCR showed more discriminative between strains than the PCR-RFLP and serotype.
Considered OMPs as one of virulent factors, analysis of the OMPs performed using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Analysis of the OMPs from H. parasuis reference strains and the isolates showed 2 kinds of OMP patterns by the size of two major bands.
Because of homogeneous OMP profiles, all H. parasuis isolates seemed to be virulent. Most isolates were highly susceptible to cephalothin and linco-spectin, but highly resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole, erythromycin and tetracycline.
The results of this study might be useful for studying the epidemiology of H. parasuis infection and give valuable description of the present outbreaks and important clues for prevention of H. parasuis infection in Korea.
Out of 50 H. parasuis isolates, 12 isolates were untypable, 6 isolates were serovar 12, 4 isolates were serovar 4 and the rest each isolate was serovar 2, 4 and 11, respectively. All H. parasuis isolates produced 821 bp product by the PCR with species-specific primers.
To analyze partial sequence of 16S rRNA gene of 15 serovars of H. parasuis, 1,475 bp size serovar specific amplicons were amplified by PCR, cloned into pGEM-T easy vector, and their sequences were analyzed. Most sequence of 16S rRNA gene were found to be highly conserved but highly pleomorphic in the regions from 50 to 80 bp, 150 to 200 bp, and 800 to 900 bp.
Whole cell lysates and outer membrane protein (OMP) prepared from H. parasuis reference strains and isolates were analyzed by SDS-PAGE and probed with the pig convalescent sera. Only two major bands were distinctively recognized, which turned out to be OMPs and cross reactive among different serovars. This indicates the OMPs of H. parasuis can be a vaccine component for cross protection.
Bivalent autogenous bacterin with two different non-typable H. parasuis isolates was developed and tested for its safety and immunogenicity in the field. The weaned piglets were injected 2 times two weeks apart and the vaccinated pigs did not show any adverse reaction to immunization. After second vaccination the geometric mean titers measured by ELISA were much higher compared to the non-immunized pigs. The usefulness of this bivalent bacterin to control the disease should be further evaluated by challenge study with heterologous H. parasuis strains.
The results of this study may give some clues for the development of improved vaccines that help combat the persistence of H. parasuis in swine farms.
2. Future plan for the use of the research results and suggestion
The porcine polyserositis is prevalent occuring disease over the world including Korea. So, we will promote to gain the permission as soon as possible. When we prepare to export our diagnostic kit abroad, some countries require the National Cerificate of analysis. At this time, we surely need the assistance of government.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 8
• CONTENTS ... 13
• 목차 ... 17
• 제 1장 연구개발과제의 개요 ... 21
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 26
• 제 1 절 실험재료 및 방법 ... 26
• 1. H. parasuis의 분리 기법 확립 및 균 특성 연구 ... 26
• 가. 분리배지 및 배양 조건의 최적화 실험 ... 26
• 나. Stock medium의 선발시험 ... 26
• 다. H. parasuis 의 항생제 감수성 검사 ... 26
• 라. H. parasuis 의 보관조건에 따른 생존능 조사 ... 27
• 마. H. parasuis의 공시균주 및 야외 분리주의 분리 ... 28
• 2. 분자생물학적 H. parasuis 진단 기법의 개발 ... 29
• 가. 16S rRNA 유전자를 이용한 H. parasuis 진단용 PCR 기법의 확립 Ⅰ ... 29
• 1) 유전자의 분리 ... 29
• 2) Polymerase chain reaction (PCR) ... 30
• 3) Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ... 30
• 나. 16S rRNA 유전자를 이용한 H. parasuis 진단용 PCR 기법의 확립 Ⅱ ... 31
• 1) Chromosomal DNA 추출 ... 31
• 2) PCR을 이용한 유전자의 증폭 ... 32
• 3) Plasmid DNA 분리 ... 33
• 4) DNA의 제한효소 절단 ... 33
• 5) Ligation에 의한 재조합 plasmid 제작 ... 33
• 6) 대장균의 형질전환 ... 34
• 7) 재조합 plasmid 선별 ... 35
• 다. DNA 염기서열 분석 ... 35
• 1) DNA 추출 ... 35
• 2) Primer 및 반응 조건 ... 35
• 3) Terminator Cycle Reaction ... 36
• 4) 유전자 형질전환에 사용된 균주 및 plasmid ... 37
• 5) 배지 및 배양조건 ... 37
• 라. H. parasuis genotyping을 위한 Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)-PCR 기법의 확립 ... 40
• 1) Primers ... 40
• 2) chromosomal DNA의 분리 ... 40
• 3) ERIC-PCR 조건 ... 41
• 마. H. parasuis 특이 유전자의 선별 및 특성 조사 ... 41
• 1) H. parasuis 로부터의 유전자 추출 ... 41
• 2) 라이브러리의 작성 ... 41
• 3) 외래유전자 도입 집락의 선별 ... 42
• 4) PCR 프라이머와 PCR 수행 조건 ... 43
• 바. Pulsed-Field Gel Electrophoresis(PFGE) ... 43
• 3. 혈청학적 진단기법의 확립 및 진단키트의 개발 ... 45
• 가. H. parasuis 외막단백질 분석을 위한 외막단백질의 추출 ... 45
• 나. SDS-PAGE ... 45
• 다. 항체의 제조와 H. parasuis 분리주의 혈청형 분석 (serotyping) ... 45
• 라. Agar gel prepripitation (AGP) test ... 46
• 마. H. parasuis에서 추출한 외막단백질의 ELISA용 항원으로서의 혈청형별 특이성 비교 실험 ... 47
• 1) 균주 배양 ... 47
• 2) 균액의 수확 및 단백질 추출 ... 47
• 바. H. parasuis에서 추출한 LPS의 항원형 분석 ... 48
• 1). LPS extraction of H. parasuis ... 48
• 2). Silver 염색 ... 48
• 사. 항원 coating 및 coating 농도 결정 ... 48
• 아. H. parasuis 감염 진단용 ELISA 진단키트의 개발 ... 49
• 1) 특이 단백질의 코팅조건 확립 ... 49
• 4. 백신 후보균주의 선발 및 백신의 효력시험 ... 49
• 가. 세포외막 (outer membrane, OMP)의 분리 및 분석 ... 49
• 나. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ... 50
• 다. Western hybridization ... 51
• 라. 백신 후보 균주의 mouse에서의 병원성 시험 ... 51
• 마. 불활화 백신의 대량 제조 ... 52
• 바. 야외농장을 대상으로 한 백신의 효력 및 독성 시험 ... 53
• 사. 항체가 측정을 위한 ELISA 조건 확립 및 혈청검사 ... 53
• 제 2 절 실험 결과 및 고찰 ... 55
• 1. H. parasuis의 분리 기법 확립 및 균 특성 연구 ... 55
• 가. 분리배지 및 배양 조건의 최적화 실험 ... 55
• 1) 가검재료에서의 채취부위의 확립 ... 55
• 2) 분리배지의 비교 ... 56
• 3) 배양 조건별 배양 결과 ... 56
• 나. Stock medium의 선발 ... 57
• 다. H. parasuis의 항생제 감수성 검사 ... 57
• 라. H. parasuis의 실험용 균주 보관조건에 따른 생존능 실험 ... 58
• 마. H. parasuis의 공시균주 및 야외 분리주의 분리 ... 59
• 1) H. parasuis 표준 혈청형 균주의 확보 ... 59
• 2) H. parasuis recovery 방법의 확립 ... 62
• 3) 국내 분리주의 혈청형 분석 ... 62
• 2. 분자생물학적 H. parasuis 진단 기법의 확립 ... 64
• 가. 16S rRNA 유전자를 이용한 H. parasuis 진단용 PCR 기법의 확립 Ⅰ ... 64
• 1) PCR ... 64
• 2) RFLP ... 65
• 나. 16S rRNA 유전자를 이용한 H. parasuis 진단용 PCR 기법의 확립 Ⅱ ... 68
• 1) 혈청형 분석용 PCR ... 68
• 2) 각 혈청형에 따른 HP 16S rRNA primer를 이용한 PCR ... 69
• 3) Pasteurellaceae 및 Enterobacterceae 에 대한 HP 16s RNA primer의 특이성 검사 ... 70
• 다. 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석 ... 76
• 라. H. parasuis genotyping을 위한 Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus(ERIC)- PCR 기법의 확립 ... 81
• 마. H. parasuis 특이 유전자의 선별 및 특성 조사 ... 85
• 1) H. parasuis 특이 유전자(2A3)에 대한 PCR 검사 결과 ... 85
• 2) 혈청형별 H. parasuis에 대한 2A3 primer의 PCR 결과 ... 86
• 3) Pasteurellaceae 및 Enterobacteriaceae에 대한 2A3 primer의 특이성 시험 ... 86
• 4) PCR을 통하여 얻은 각 유전자들의 Cloning ... 87
• 바. PFGE에 의한 H. parasuis의 유전형 분석 ... 90
• 3. 혈청학적 진단기법의 확립 및 진단키트의 개발 ... 93
• 가. H. parasuis에서 추출한 외막단백질의 ELISA용 항원으로서의 혈청형별 특이성 비교 실험 ... 93
• 1) Sodium dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)를 이용한 H. parasuis 외막단백질의 단백질 분석 ... 93
• 2) H. parasuis serotype 13 & 14 ELISA 실험 결과 ... 97
• 3) H. parasuis 혈청형 13형과 14형간의 분산분석 결과 ... 99
• 나. H. parasuis에서 추출한 다당류 (LPS)의 ELISA용 항원으로서의 혈청형별 특이성 비교 실험 ... 100
• 1) LPS(Lipopolysaccharide)의 추출 ... 100
• 2) H. parasuis로부터 추출한 LPS로 ELISA kit 구성 ... 100
• 3) 특이 단백질의 코팅조건 확립 ... 101
• 제 3절 백신 후보균주의 선발 및 백신의 효력시험 ... 102
• 1. 표준주 및 분리주의 총단백질과 세포외막단백질 (OMP)의 분석 ... 102
• 2. 백신 후보균주의 선발 ... 105
• 3. 백신 후보균주의 마우스에 대한 병원성 시험 ... 106
• 4. 야외농장에서의 백신의 효과 및 안전성 분석 ... 109
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 111
• 1. 1차년도 ... 111
• 2. 2차년도 ... 111
• 3. 3차년도 ... 112
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 113
• 제 1 절 타연구에의 응용 ... 113
• 제 2 절 추가연구의 필요성 ... 114
• 제 6 장 참 고 문 헌 ... 115
• 끝페이지 ... 121