초록 ▼

◦세부과제명: 돼지파보바이러스감염증 항체검출 ELISA 평가(농림축산검역본부 수행)
1. (1년차) 돼지파보바이러스 항체검출 ELISA용 항원(VP2, NS1) 선발 및 평가패널 구축
(1) 항체검출 ELISA 생산용 목표 항원 선정
- 국내분리 PPV 항혈청을 이용한 VRI-1 strain 항원성 평가
· 국내분리PPV PVK1 strain(1980), PVK2 strain(2007)의 항혈청과 교차중화시험결과 동일한 중화항체가(256배)가 측정되어 항원 적합성 확인
- 국내분리PPV VRI-1 stra

◦세부과제명: 돼지파보바이러스감염증 항체검출 ELISA 평가(농림축산검역본부 수행)
1. (1년차) 돼지파보바이러스 항체검출 ELISA용 항원(VP2, NS1) 선발 및 평가패널 구축
(1) 항체검출 ELISA 생산용 목표 항원 선정
- 국내분리 PPV 항혈청을 이용한 VRI-1 strain 항원성 평가
· 국내분리PPV PVK1 strain(1980), PVK2 strain(2007)의 항혈청과 교차중화시험결과 동일한 중화항체가(256배)가 측정되어 항원 적합성 확인
- 국내분리PPV VRI-1 strain의 VP2유전자가 Baculovirus에서 발현된 유자재조합 VP2(recombinant VP2 : rVP2) 단백질 생산 및 항원성을 확인함
· VRI-1 strain 염기서열분석 결과 표준 PPV NADL strain과 99.3% 상동성 확인 및 PPV1 genotype1으로 분류됨
· Baculovirus 이용하여 유전자재조합 VP2단백질 발현(65.5kDa) 확인
· VP2 단백질의 혈구응집능(Haemaagglutination : HA)능 : 6x213/30ml
- NS1항체검출 ELISA 개발용 유전자재조합 NS1 단백질 발현
· PPV NS1유전자 클로닝(2,175bp) 및 염기서열분석결과 PPV1 genotype1으로 분류됨
· Baculovirus 이용하여 유전자재조합 NS1단백질 발현(76kDa) 확인

(2) 표준 및 야외 검체 확보
- PPV 표준항원 및 항혈청 확보
· PPV NADLstrain1(NVSL), NADL2 strain(ATCC) 도입 확보
· 국내분리 PPV: PVK1strain(1980), PVK2 strain(2007) 바이러스 확보 및 증식완료
· 표준항혈청으로 NVSL(미국) 및 VMRD(미국)에서 PPV antiserum(HI titer : 256) 및 형광항체콘쥬게이트(FA conjugate) 1종 확보 국내분리주와 반응성 확인함
- PPV 야외항원 및 야외혈청 확보
· 2016년 9-10월, 경북 지역 돼지 야외 시료 347점 수집함
· HI test 결과 음성혈청 97개, 양성혈청 250개 확보함
· 종돈장 혈청 1,851개 수집함

2. (2년차) 돼지파보바이러스 항체검사 ELISA 유효성 평가(농림축산검역본부 수행)
(1) 종돈장내 돼지파보바이러스 항체 분포조사 : HI test
- 종돈장내 사육구간별 돼지파보바이러스 항체 분포는 백신을 접종하는 모돈군의 평균HI 항체가는 50,760였으며, 백신을 접종하지 않는 자돈 비육돈군의 평균HI항체가는 항체가 3,770로 양돈장내 PPV가 번식돈군에서 자돈, 비육돈군 간에 순환감염이 추정됨

(2) 돼지 시료에서 돼지파보바이러스 검사 및 분리
- 158건의 돼지 시료에서 돼지 파보바이러스 160건 양성검출(양성율42.5%)
·시료별 양성율 : 유․사산태아(9.3%(7/75)),폐(58.5%(117/200)),혈액(72.0%(36/50))
- PPV 3주 분리 : genotypeI 2주(PPV47, PPV 49), gentype2 1주(PPV82)
- 최근 야외 분리 PPV VP2 유전자 분석
·유전자 염기서열 상동성 및 Phylogenetic 분석: 표준주 NADL2와는 99.14%, VRI-1(1998)과는 98.91%, PVK1(1980) 99.08%, PVK2(2007) 99.14% 상동성을 확인하였음
·분리된 바이러스 PPV82 strain은 아미노산서열분석 결과 genotype2로 분류되고 고병원성 바이러스와 유사한 바이러스로 추정됨

(3) PPV VP2 항체검사 ELISA 유효성 평가
가) Solid-phase Commpetetion ELISA(SC-ELISA)
- ELISA용 Antigen : PVK2-VP2 및 VRI-1 VP2 유전자재조합단백질 사용
- 검사혈청 : 번식 및 비육돈 혈청 1,544개
- 대조 표준항체검사법 : HI test
- SC-ELISA 효능 : 민감도 100%(1,485/1,485), 특이도 93.2%(55/59), 정확도 99.7%

나) Indirect ELISA
- ELISA용 Antigen : VRI-1 VP2 유전자재조합단백질 사용
- 검사혈청 : 번식 및 비육돈 혈청 132개(도축장채혈)
- 대조 표준항체검사법 : HI test
- Indirect-ELISA 효능 : 민감도 77%(20/26), 특이도 88%(42/48)

다) Liquid-phase Competetion ELISA(LC-ELISA)
- ELISA용 Antigen : VRI-1 VP2 유전자재조합단백질 사용
- 검사혈청 : 번식 및 비육돈 혈청 34개
- 표준항체검사법 : HI test
- LC-ELISA 효능 : 민감도 100%(34/34), 특이도 98.7%(34/34)

(4) PPV NS1 항체검사 Indirect-ELISA 유효성 평가
- ELISA용 Antigen : VRI-1 NS1 유전자재조합단백질 사용
- 검사혈청 : 번식 및 비육돈 혈청 000개
- 표준항체검사법 : HI test (음성혈청: 비감염, 양성혈청: 백신또는 감염판정)
- 효능 : 평가중

◦세부과제명: 돼지파보바이러스감염증 항체 효소면역법 시제품 생산 및 개선 (산업체 수행)
1. 목표(1년차): 돼지파보바이러스감염증 항체 ELISA 개발용 항원 및 기초 물질 생산
(1) ELISA 개발용 항원 및 항체 등 기초물질 생산
- PPV 불활화 항원 정제 방법 확립 (약 32배 농축)
- PPV 재조합 VP2 제작을 위해 baculovirus 및 E.coli 클론 작성, VP2 단백질 발현 및 정제 조건 확립 (His-tagging)
- PPV (VRI-I) whole virus 면역화를 통한 단클론항체, 다클론항체 제작(토끼 항혈청)
- 혈구응집저해능을 보이는 단클론항체 3종 발굴
(2) 평가용 ELISA kit 생산 : 시제품으로 생산하여 1세부과제에서 평가용으로 제공

2. 목표(2년차):돼지파보바이러스감염증 항체 ELISA 시제품 생산
(1) 항체 ELISA 시제품 생산
가) Solid-phase Competetion ELISA(SC-ELISA)
- SC ELISA(불화화 항원) 시제품 생산
- SC ELISA(재조합 VP2) 시제품 생산 : 코팅항원은 2ug/mL, anti-PPV VP2 mAb–HRP(9A8 clone) 400ng/ml의 조건으로 시제품 생산
나) Indirect ELISA
- Indirect ELISA(불화화 항원) 시제품 생산
- Indirect ELISA(재조합 VP2) 시제품 생산 : 코팅항원은 4ug/mL, goat anti-swine IgG-HRP 50ng/ml의 조건으로 시제품 생산
다) Liquid-phase Competetion ELISA(LC-ELISA)
- LC ELISA(불화화 항원) 시제품 생산
- LC ELISA(재조합 VP2) 시제품 생산 : Liquid phase competition ELISA를 위한 조건 설정 및 양성/음성검체에서의 반응성 확인 결과, PPV 불활화 항원을 이용한 ELISA는 HI 역가와 상관성이 98.2%, PPV 재조합 VP2 이용한 ELISA는 HI 역가가 상관성은 53.1%으로 평가됨

(출처 : 연구결과 요약 2p)

Abstract ▼

Porcine parvovirus (PPV), belonging to the genus Parvovirus of the family Parvoviridae, is a major infectious pathogen of reproductive failure in swine. Serological testing for PPV infection is mostly performed with a haemagglutination inhibition (HI) test or a virus neutralization (VN) test.

Porcine parvovirus (PPV), belonging to the genus Parvovirus of the family Parvoviridae, is a major infectious pathogen of reproductive failure in swine. Serological testing for PPV infection is mostly performed with a haemagglutination inhibition (HI) test or a virus neutralization (VN) test.

However, Current serological techniques cannot determine whether PPV the causal agent of the disease is present. All of these techniques require a considerable degree of expertise on the part of the operator, particularly with regard to reading the interpreting the results. In addition, the FA and HA tests have the drawbacks of non-specificity and low sensitivity. As isolation of virus and PCR assay were reported to be unsuitable for large-scale routine diagnostic operation, it is necessary to develop a simple and easy to operate serological test.

The gene encoding the VP2 protein of porcine parvovirus (PPV) was expressed in an insect-baculovirus system. The recombinant (r) VP2 was similar antigenically/functionally to the native capsid protein as demonstrated by hemagglutination (HA), Western blotting using PPV positive sera. The purified rVP2 proteins were used as coating antigen to establish a rVP-ELISA were:the concentration of rVP2 proteins coated on the wells was 400ng/well; the diluted concentration of serum was 1 : 2 and that of the enzyme-labeled antibody was 50ng/well.

For the development of an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect antibodies against PPV, we evaluated recombinant VP2 porcine parvovirus as an antigen of ELISA. VP2 proteins expressed in the baculovirus expression system were used as antigen to establish and blocking ELISA method for the detectioning PPV antibodies. Further effort will be made to increase the diagnostic sensitivity and specificity of ELISA kit assay.

(출처 : 영문초록 43p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 2
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 6
• 1. 연구배경 ... 6
• 2. 연구최종목표 ... 7
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 8
• 1. 재 료 ... 8
• 2. 연구전략 및 방법 ... 8
• Ⅲ. 연구결과 ... 9
• 1. 제1세부과제명 : 돼지파보바이러스감염증 항체검출 ELISA 평가(농림축산검역본부수행) ... 9
• 2. 제2세부과제명 : 돼지파보바이러스감염증 항체 효소면역법 시제품 생산 및 개선(산업체 수행) ... 24
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 38
• 1. (1년차) 돼지파보바이러스 항체검출 ELISA용 항원(VP2, NS1) 선발 및 평가패널 구축(검역본부 수행) ... 38
• 2. (2년차) 돼지파보바이러스 항체검사 ELISA 유효성 평가(검역본부 수행) ... 38
• 3. 목표(1년차): 돼지파보바이러스감염증 항체 ELISA 개발용 항원 및 기초 물질 생산 ... 39
• 4. 목표(2년차):돼지파보바이러스감염증 항체 ELISA 시제품 생산(산업체 수행) ... 39
• Ⅴ. 고 찰 ... 41
• Ⅵ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 42
• Ⅶ. 주요연구과제 변경사항 ... 42
• Ⅷ. 참고자료 ... 42
• IX. 영문초록 ... 43
• 끝페이지 ... 43