초록 ▼

가. 연구결과
1) 고무입자-결합 단백질(SRPP)을 발현하는 재조합 미생물
(한국특허등록, 국제특허출원)
본 발명은 고무나무(H. brasiliensis) 라텍스로부터 유래된 작은 고무나무 입자에 결합하는 고무입자-결합 단백질(snall rubber particle protein, 'SRPP')을 코딩하는 유전자, 전기 유전자로부터 유추되는 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP), 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터와 이로 형질전환된 재조합 미생물, 및 재조합 SRPP를 이용한 고무의 생합성방법에 관한 것이다.

가. 연구결과
1) 고무입자-결합 단백질(SRPP)을 발현하는 재조합 미생물
(한국특허등록, 국제특허출원)
본 발명은 고무나무(H. brasiliensis) 라텍스로부터 유래된 작은 고무나무 입자에 결합하는 고무입자-결합 단백질(snall rubber particle protein, 'SRPP')을 코딩하는 유전자, 전기 유전자로부터 유추되는 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP), 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터와 이로 형질전환된 재조합 미생물, 및 재조합 SRPP를 이용한 고무의 생합성방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 미생물로부터 발현되는 재조합 SRPP는 고무입자의 존재시 고무합성을 촉진시키므로, 전기 재조합 SRPP를 생물학적 방법에 의한 고무생산에 활용할 수 있을 것이다.
2) 고무나무에서 분리한 이소펜테닐 이인산 이성화효소 및 이를 이용한 고무의 제조 방법 (한국 및 국제틑특허 등록)
브라질 고무나무(Hevea brasiliensis)의 유액의 cDNA 라이브러리에서 이소펜테닐 이인산(IPP) 이성화효소로(EC 5.3.3.2) 암호화되는 cDNA 클론을 클로닝하였다. 그 클론은 예상되는 분자령이 26.7 kDa인 234개 아미노산의 펩타이드로 암호화되는 연속적인 오픈 리딩 프레임을 가진다. 추론된 단백질은 4.7의 등전점을 가지는 산성이고 다른 IPP 이성화효소와 높은 서열 동일성을 나타낸다. 대장균(Escherichia coli)에서 발현된 재조합 단백질은 IPP 이성화효소 활성을 나타낸다. 개시제인 알릴 이인산을 제거한 세척된 고무 임자(WRP)를 사용하여 반응 혼합물에 IPP 이성화효소를 첨가하고 시험관내 고무의 생합성 분석을 실행하였다.
3) 애기장대에서 cis-prenyl transferase의 분리, 발현 및 기능분석 - 고무생합성에 관련성 검토
cis-Prenyltransferase는 IPP를 allylic diphosphate에 연속적으로 결합시켜 polyprenyl diphosphates를 만드는 과정을 촉매한다. 본 연구진은 식물체에서 최초로 애기장대에서 이 효소를 만드는 유전자를 분리하여 동정하였다. In vitro 고무 생합성 분석결과 애기장대 cis-prenyl transferase는 고무와 같은 큰 분자량의 polyprenyl diphosphates를 만들지 못하는 것을 밝혔다.
4) 해바라기에서 geranylgeranyl pyrophosphate synthase의 분리, 동정 및 기내발현
Geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) synthase는 terpenoid 화합물 생합성의 주효소로서 식물생장 발달과 개체간 상호작용에 중요한 역할을 한다. 본 연구진은 이 효소의 cDNA 해바라기에서 분리 동정하였다. 조직별 발현양상을 연구한 결과 seed imbibition 2일 후부터 발현되며 ABA 처리는 이 유전자의 발현을 억제하였다.
5) 해바라기 재생 및 형질전환
해바라기의 효과적인 형질전환 체계를 확립하기 위하여 과제 시작 단계부터 지속적인 노력을 기울였으며 최근 기존의 방법보다 빠르고 효율적인 형질전환 방법을 개발하여 그 효율을 극대화하는 연구를 진행하였다. 이 방법의 특징은 embryo meristem를 가지고 있는 hypoeotyl을 이용하여 shoot가 바로 hypoeotyl에서 올라오도록 함으로서 calus를 거치지 않게 하는 것이다. 해바라기의 형질전환을 매우 어렵게 하는 것은 callus에서 식물체 재생 (regeneration)이 원활하지 못하기 때문인데, 본 방법을 도입함으로써 callus에서 shoot로의 재생과정이 생략됨으로서 가장 큰 어려움을 피하면서 또한 시간상 절약을 가져 올 수 있었다. 해바라기의 형질전환체 조기확보와 기술개발체계 확립을 위하여 러시아 모스코바 Russian Academy of Science의 Alex Gaponenko 교수팀과 국제 공동연구를 수행하고 있다.
6) 고무나무의 생리환경적 요인 및 재배기술
무화과(Ficus carica)는 아열대성의 반교목성 낙엽 과수로 재배가 쉽고 병해충 피해가 적다. 우리나라에서는 경남, 전남의 만해안 지역과 제주도에서 경제재배가 가능하고 경북 및 전북 일부 지역에서도 재배가 되고 있다. 본 실험에서는 무화과 수액을 일정 간격으로 영암 과수원 및 농과대학 포장에 정직한 무화과로부터 채취하여 무기성분 및 고무함량의 변화를 시기별로 분석하였다. 또한 무화과 나무와 같은 속인 Ficus benghalensis의 고무 생합성에 관해서도 연구를 수행하였다.
7) Ficus benghalensis에서 천년고무 생합성 특성조사
Ficus benghalensis가 천연고무를 생합성하는 것을 최초로 밝히고 Latex와 고무입자에서 고무생합성 활성 정도를 조사하였다. Latex의 고무함량은 약 17%이고 GPC 분석을 고무 크기가 약 1,500 kDa 정도되는 것을 밝혔다. 이러한 연구결과는 Ficus benghalensis가 대체고무작물로 이용될 수 있는 좋은 후보임을 보여주었다.
8) Ficus carica, Ficus benghalensis, 및 Hevea brasiliensis에서 고무입자의 미세 형태분석 및 단백질 특성 조사
고무생합성은 고무임자의 표면에서 일어난다. 이 고무입자들은 monolayer 세포막으로 싸여있다. 고무임자에 대한 이해를 증진시키기 위하여 the Ficus carica, Ficus benghalensis, and Hevea brasiliensis의 미세구조를 전자 현미경으로 조사하였다. 세 종류의 고무입자들은 모두 구형이었고 입자크기는 Hevea것이 다른 것보다 작았다. Hevea 고무입자 표면에 있는 24 kDa 단백질과 CPT 단백질이 고무 생합성에 직접적인 역할을 하는 것 같지 않았다.

Abstract ▼

1. Results
1) Recombinant microorganism that expresses rubber particle-bound protein (SRPP) - patented in Korea and submitted Lo USA for paLenting
This invention is related to tubber biosynthesis using SRPP-encoding gene from Hevea, its recombinant protein, transformed microorganism. The recom

1. Results
1) Recombinant microorganism that expresses rubber particle-bound protein (SRPP) - patented in Korea and submitted Lo USA for paLenting
This invention is related to tubber biosynthesis using SRPP-encoding gene from Hevea, its recombinant protein, transformed microorganism. The recombinant SRPP was found to stimulate rubber biosynthesis in presence of washed rubber paticles.
2) Methods to produce natural rubber using isopentenyl pyrophosphale isomerase isolated from Hevea. - patented in USA and Korea
We have cloned isopentenyl pyrophosphate isomerase from eDNA library of Hevea brasiliensis latex. We tested rubber biosynthesis in vitro by adding this enzyme to washed rubber particles.
3) Molecular Cloning, Expression, and Functional Analysis of a cis-Prenyl-transferase from Arabiclopsis thaiana -IMPLICATIONS IN RUBBER BIOSYNTHESIS*
cis-Prenyltransferase catalyzes the sequential condensation of isopentenyl diphosphate with allylie diphosphate to synthesize polyprenyl diphosphates that play vital roles in cellular activity. We have isolated and characterized the first plant cis-prenyltransicrase from Arabidopsis thaliana. in vitro rubber biosynthesis analysis indicated that the Arabidopsis cis-Prenyltransferase itself could not catalyze the formation of higher molecular weight polyprenyl diphosphales similar to natual rubber.
4) Cloning, characterization, and heterologous expression of a functional geranylgeranyl pyrophosphate synthase from suntlovler (Helianthus annuus L.)
Geranylgeranyl pyrophosphale (GGPP) synthase is a key enzyme for the biosynthesis of terpenoid compounds that play vital roles in plant growth and development, and interactions between organisms. We have cloned and cllaracterized a sunflower eDNA encoding GGPP synthase. In vitro activity assay using recombinant protein and genetic complementation experiments have shown that the eDNA we cloned encodes for functional GGPP synthase. Gene expression studies using sunflower seedlings showed that the gene was expressed after two days of seed imbibition. Abscisic acid treatment down-regulated the expression of the gene.
5) Regeneration and trasformation of sunflower
We have develop the fast and efficient transformation method. The method does not go through regeneration steps of callus but directly induces shoots from embryo meristem of hypocotyls. For more efficient progress of sunflower transformation, we made international collaboration contract with Russian Academy of Science.
6) Cultivation technique of rubber trees and effects of environmental factors on rubber production.
Ficus carica is rubber-producing tree and can be cultivated in southern parts of Korea and Cheju island. We have analyzed seasonal change in mineral and rubber content of Ficus carica and Ficus benghalensis.
7) Charaterization of Natural Rubber Biosynthesis in Ficus benghalensis
Natural rubber was identified for the first time in the latez of Ficus benghlensis, and the ruber biosynthetic activity in latez and rubber particle was investigated. 13C NMR analysis of samples prepared by successive eztractions with acetone and benzene confirmed that the benzene-soluble residues were a natural rubber, cis-1,4-polyisoprene. The rubber content in the latex of F. benghalensis was approximately 17%. Gel permeation chromatography revealed that the molecular size of the natural rubber from F. benghalensis was approximately 1,500 kDa. The high rubber content and large molecular size suggest that F. benghalensis is a good candidate for an alternative rubber source.
8) Micromorphological and protein characterzation of rubber particle in Ficus carica, Ficus benghlaensis, and Hevea brasiliensis
Rubbber biosynthesis takes place on the surface of rubber particles. These particles are surrounded by a monolayer membrane in which the rubber transferase is anchored. In order to gain better insight into whether rubber particles from different plant species share common structural characteristics, the micromorphology of rubber particles from Ficus carica, Ficus benghalensis, and Hevea brasiliensis was examined by electron microscopy. Rubber particles of all three species were spherical in shape, and the size of rubber particles of H. brasiliensis was much smaller than that of F. carica and F. benghalensis. These results indicate that rubber particles in the three different piunt species investigated share some degree of similarity in architecture.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 10
• 목차 ... 13
• 제 1 장 연구개발 과제의 개요 ... 16
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 16
• 제 2 절 연구개발의 세부목표 및 내용 ... 21
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 제 1 절 국내의 기술개발 현황 ... 23
• 제 2 절 외국의 기술개발 현황 ... 24
• 제 3 절 국내외 기술개발에 차지하는 본 연구 결과의 위치 및 기여도 ... 26
• 제 3 장 고무입자-결합 단백질 (SRPP)뜰 발현하는 재조합 미생물 ... 28
• 제 1 절 요약 ... 28
• 제 2 절 명세서-도면의 간단한 설명 ... 28
• 제 3 절 발명의 상세한 설명 ... 29
• 제 4 절 실시예 ... 36
• 제 5 절 발명의 효과 ... 42
• 제 6 절 청구의 범위 ... 42
• 제 7 절 대표도면 ... 45
• 제 4 장 고무나무에서 분리한 이소펜테닐 이인산 이성화효소 및 이를 이용한 고무의 제조 방법 ... 51
• 제 1 절 요약 ... 51
• 제 2 절 면세서-도면의 간단한 설면 ... 52
• 제 3 절 발명의 상세한 설명 ... 53
• 제 4 절 실시예 ... 62
• 제 5 절 발명의 효과 ... 66
• 제 6 절 청구의 범위 ... 70
• 제 7 절 대표도면 ... 74
• 제 5 장 Molecular Cloning, Expression, and Functional Analysis of a cis-Prenyl-transferase from Arabidopsis thaliana -IMPLICATIONS IN RUBBER BIOSYNTHESIS* ... 78
• Ⅰ. Abstract ... 78
• Ⅱ. Introduction ... 79
• Ⅲ. Materials and Methods ... 81
• Ⅳ. Results ... 85
• Ⅴ. Discussion ... 93
• Ⅵ. References ... 97
• 제 6 장 Cloning, characterization, and heterologous expression of a functional geranylgeranyl pyrophosphate synthase from sunflower (Helianthus annuus L.) ... 99
• Ⅰ. Summary ... 99
• Introduction ... 100
• Material and Methods ... 102
• Results and Discussion ... 105
• References ... 112
• 제 7 장 해바라기 재생 및 형질전환 ... 116
• 제 1 절 해바라기 조직 배 양 ... 116
• 제 2 절 형질전환 최적조건 탐색 ... 118
• 제 3 절 형질전환체 선발 및 분석 ... 122
• 제 8 장 고무나무의 생리환경적 요인 및 재배기술 ... 127
• 제 1 절 서언 ... 127
• 제 2 절 무화과(Ficus carica) 수액의 고무함량 및 무기성분 분석 ... 128
• 제 3 절 무화과와 벵갈 고무나무(Ficus benghalensis)수액의 고무함량에 미치는 환경요인 ... 134
• 제 4 절 벵갈 고무나무의 천연고무합성의 특성 ... 139
• 제 5 절 Ficus carica, Ficus benghalensis 및 Hevea brasiliensis 고무입자의 미세형태 및 단백질 특성 ... 142
• 제 6 절 결론 ... 146
• 제 7 절 참고문헌 ... 148
• 제 9 장 Characterization of Natural Rubber Biosynthesis in Ficus benghalensis ... 153
• Abstract ... 153
• Introduction ... 154
• Results ... 155
• Discussion ... 159
• Materials and Methods ... 161
• References ... 165
• 제 10 장 Micro-morphological and protein characterization of rubber particle in Ficus caica, Ficus benghalensis, and Hevea brasiliensis ... 175
• Abstract ... 175
• Introduction ... 176
• Materials and Methods ... 178
• Results ... 181
• Discussion ... 184
• References ... 188
• 끝페이지 ... 197