초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
사람 락토페린을 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 작제하여 PCR 및 ELISA로 F2까지 사람 락토페린이 발현하는 것을 확인하였다. 또한 락토페린을 발현하는 제브라피쉬 치어를 파쇄하여 세균에서 항균효과가 있음을 실험을 통하여 증명하였다. 락토페린을 발현하는 제브라피쉬 치어를 이용하여 소화기 병원성 그람 음성균으로 돼지에서 salmonella cholerasuis 다음으로 장염을 일으키는 주된 원인세균인 salmonella typhimurium을 마우스에 감염시켜 각 장기에서 락토페린의 미생물 방어 효과를 검증한

Ⅳ. 연구개발결과
사람 락토페린을 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 작제하여 PCR 및 ELISA로 F2까지 사람 락토페린이 발현하는 것을 확인하였다. 또한 락토페린을 발현하는 제브라피쉬 치어를 파쇄하여 세균에서 항균효과가 있음을 실험을 통하여 증명하였다. 락토페린을 발현하는 제브라피쉬 치어를 이용하여 소화기 병원성 그람 음성균으로 돼지에서 salmonella cholerasuis 다음으로 장염을 일으키는 주된 원인세균인 salmonella typhimurium을 마우스에 감염시켜 각 장기에서 락토페린의 미생물 방어 효과를 검증한 결과 항균효과가 있음을 확인하였다. 마지막으로 산업동물인 돼지를 이용한 미생물 방어 효과 실험에서는 유의적인 결과를 확인할 수 없었다.

Abstract ▼

II. Technology Introduction
Lactoferrin is one of the strongest anti-viral, anti-bacterial material, which is contained in colostrum of cow and human in nature. In recent years, lactoferrin has known that it can protect disease infections, malignant tumors, AIDS and cancers, so it becomes an obje

II. Technology Introduction
Lactoferrin is one of the strongest anti-viral, anti-bacterial material, which is contained in colostrum of cow and human in nature. In recent years, lactoferrin has known that it can protect disease infections, malignant tumors, AIDS and cancers, so it becomes an object of attention. It was revealed that milk protein lactoferrin has an effect about protecting of pathologic bacterial contamination in meat.
There are many studies for using broad physiological effect of lactoferrin, and livestock and medical industry have accomplished purpose about cursing disease and anti-biotic effect. People can get lactoferrin only from colostrum, so it is very expensive - about 300$ per kg. Many country including south Korea have tried to make large scale production of recombinant lactoferrin using genetic engineering. But there is no example about effective commercialization of lactoferrin in our country. We should totally depend on importation of lactoferrin if we need it.
In our research, lactoferrin is chosen as feed additives instead of antibiotics. The final goal of this research is the large scale production of recombinant human lactoferrin and making animal food.
III. Features
We made transgenic zebrafish which can give people human lactoferrin. These zebrafish were determined about expression lactoferrin by PCR and ELISA. We established method how crystallize pure lactoferrin from transgenic zebrafish and then compared structure and anti-bacterial function between the lactoferrin and commercial lactoferrin. We used Balb/c mice to verify anti-bacterial effect of recombinant human lactoferrin from transgenic zebrafish. Finally, we gave pigs mixed feed with pulverized transgenic zebrafish.
IV. Efficiency
We made transgenic zebrafish which express human lactoferrin and confirmed expression of human lactoferrin by PCR and ELISA to F2 generation. We pulverized zebrafish larvae which express human lactoferrin. We used that powder to demonstrate anti-bacterial effect from in vitro test. We also confirmed anti-bacterial effect of recombinant human lactoferrin from transgenic zebrafish by injected salmonella typhimurium to balb/c mice. Salmonella typhimurium is the second pathogen of enteritis of pigs: the first pathogen is salmonella cholerasuis. Finally, we challenged anti-bacterial experiment with pigs which are one of the famous industrial animal. But we could not get significant data about that.
V. Applications & Results
This methods for vector construction and generation of transgenic zebrafish provide a standard or other transgenic studies. If the muscle vector which we succeeded in making transgenic zebrafish can be used actual conditions and determined its applications, our vector has enough marketability.

목차 Contents

• 표 지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 5
• CONTENSTS ... 7
• 목 차 ... 10
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 12
• 제 1절 연구목표 ... 12
• 1. 최종 연구목표 ... 12
• 2. 락토페린 선정 이유 ... 12
• 3. 단계별 연구목표 ... 12
• 제 2절 연구내용 ... 13
• 1. 1년차 연구내용 : 사람 락토페린을 발현하는 형질전환 제브라피쉬 작제 ... 13
• 2. 2년차 연구내용 : 형질전환 제브라피쉬에서 사람 락토페린 분리 정제 및 분리한 락토페린의 특성 규명과 미생물 방어효과 검증 ... 13
• 3. 3년차 연구내용 : 사람 락토페린을 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 산업화 기반마련 ... 14
• 제 3절 연구개발의 필요성 ... 14
• 1. 연구개발대상 기술의 경제적·산업적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 19
• 제 1절 세계적 수준 ... 19
• 제 2절 국내 수준 ... 19
• 제 3절 국내·외의 연구현황 ... 19
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
• 제 1절 연구 범위 및 연구 수행 방법 ... 20
• 1. PCR을 이용한 Human Lactoferrin 유전자 확보 및 염기서열 확인 ... 20
• 2. 사람 락토페린 유전자를 가진 재조합 벡터 제작 ... 20
• 3. 재조합 락토페린 벡터를 제브라피쉬 수정란에 주입 ... 21
• 4. 형질전환 제브라피쉬에서의 락토페린 발현 확인 ... 21
• 5. 락토페린 유전자 확보 ... 22
• 6. Muscle promoter의 선별 ... 23
• 7. 다양한 발현벡터의 이용 ... 23
• 8. 형질전환 제브라피쉬 founder 와 F1, F2 에서의 락토페린 발현 확인 ... 24
• 9. 사람 락토페린을 발현하는 형질전환 제브라피쉬 라인의 선별 ... 25
• 10. 락토페린의 정제 ... 25
• 11. In vitro 항생효과 검증 ... 25
• 12. in vivo 항생효과 검증 ... 28
• 13. Lactoferrin 발현 Zebrafish 의 사료첨가제 제조 및 산업동물에 효과 측정 ... 29
• 제 2절 세부 연구 수행 결과 ... 30
• 1. 사람 락토페린 cDNA를 이용하여 클로닝후 염기서열확인 ... 30
• 2. Xenopus EF1α 프로모터 벡터를 이용하여 사람 락토페린 벡터 제조 ... 32
• 3. Muscle promoter의 선별 ... 33
• 4. pMDS6/MLC#2Lactoferrin 및 LactoferrinGFP의 삽입 ... 35
• 5. GAL4UAS/Lactoferrin cloning ... 36
• 6. 제브라피쉬 사육 확립 및 수정란 획득 ... 37
• 7. 재조합 락토페린 벡터를 제브라피쉬 수정란에 주입 ... 38
• 8. 형질전환 제브라피쉬에서 사람의 락토페린 발현 확인 ... 39
• 9. Transgenic zebrafish F0, F1에서의 lactoferrin 발현 확인 ... 43
• 10. 재조합 제브라피쉬 락토페린의 분말에 대한 성분 조성 및 특성 분석 ... 46
• 11. 재조합 제브라피쉬 락토페린의 3차원적 구조 규명 (아미노산 염기 구조 분석) ... 49
• 12. 항생효과 검증 실험 (In vitro) ... 50
• 13. 항생효과 검증 실험 (In vivo) ... 52
• 14. 락토페린 발현 제브라피쉬의 사료첨가제 제조 및 사료의 효능 실험 ... 57
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 67
• 제 1절 1년차 (2007. 5. 30. ~ 2008. 5. 29) ... 67
• 1. 연구개발목표의 달성도 ... 67
• 2. 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가 ... 68
• 제 2절 2년차 (2008. 5. 30. ~ 2009. 5. 29) ... 69
• 1. 연구개발목표의 달성도 ... 69
• 2. 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가 ... 70
• 제 3절 3년차 (2009. 5. 30. ~ 2010. 11. 29) ... 71
• 1. 연구개발목표의 달성도 ... 71
• 2. 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가 ... 71
• 제 4절 최종평가 (2007. 5. 30. ~ 2010. 11. 29) ... 72
• 1. 연구개발목표의 달성도 ... 72
• 2. 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가 ... 72
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 73
• 제 1절 논문게재 성과 ... 73
• 제 2절 국내 및 국제 학술회의 발표 성과 ... 73
• 제 3절 기술이전 성과 ... 74
• 제 4절 특허 접수 및 출원 성과 ... 74
• 제 5절 사업화 성과 ... 74
• 제 6절 인력 활용/양성 성과 ... 75
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 76
• 제 1절 국내외 관련분야의 환경 변화 ... 76
• 제 7 장 참고문헌 ... 77
• 끝페이지 ... 78