[논문]Pichia pastoris에서 사람 락토페린 N-lobe의 발현과 항균활성

원수진; 조재형; 김승환; 권혁진; 이현환

doi:10.7845/kjm.2015.5043

Pichia pastoris에서 사람 락토페린 N-lobe의 발현과 항균활성
Expression of human lactoferrin N-lobe in Pichia pastoris and its antibacterial activity 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.51 no.3, 2015년, pp.271 - 279

원수진 (한국외국어대학교 생명공학과) , 조재형 (한국외국어대학교 생명공학과) , 김승환 (한국외국어대학교 생명공학과) , 권혁진 (한국외국어대학교 생명공학과) , 이현환 (한국외국어대학교 생명공학과)

초록
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락토페린(LF)는 철이온과 결합하는 당 단백질로서 항균, 항바이러스, 항진균 등의 기능을 가지고 있으며, 생체의 각종 체액으로부터 분비되는 다기능성 단백질이다. 본 연구에서는 사람의 락토페린(hLF)으로부터 유래된 N-lobe의 유전자를 분리하고 산업용 균주로서 많이 사용되는 메탄올자화 효모인 Pichia pastoris에서 발현시켰다. 재조합 사람 락토페린 N-lobe (rhLF-N)는 배양액으로 분비 발현되었으며, 3L 발효조에서 약 $458{\mu}g/ml$이 수준으로 생성되었다. rhLF-N을 정제한 다음 SDS-PAGE와 western blot으로 분석하여 분자량 35 kDa 단백질을 확인하였으며, hLF에 대한 항체를 이용하여 면역확산법으로 면역성을 확인하였다. rhLF-N의 mRNA 발현양상을 qRT-PCR로 분석한 결과 메탄올 첨가에 의한 발현 유도 후 2-3일째에 발현율이 가장 높았으며, 4일째에는 점차적으로 감소하였다. 정제한 rhLF-N을 이용하여 항균활성을 조사한 결과 Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Salmonella typhimurium과 같은 병원성 균에 대해 광범위한 항균활성을 보였으나, LF유래 항균 peptide들과 항균활성을 비교하였을 때, 항균력이 상대적으로 매우 떨어지는 것으로 나타났다. 비록 본 연구에서 발현한 rhLF-N은 항균력은 떨어지나, hLF에 비해 그 크기가 작고 배양조건 연구로 P. pastoris에서 대량 생산이 가능하며, 배양액으로 분비시킬 수 있기 때문에 정제 비용 등을 고려 할 때 산업적 응용에는 보다 유리할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Lactoferrin (LF) is a multifunctional, iron-binding glycoprotein found in physiological secretions of mammals. LF shows antibacterial, antiviral and antifungal activities. In the present study, a gene encoding the N-terminal lobe of human lactoferrin (hLF) was isolated, cloned and expressed in methylotrophic yeast, Pichia pastoris. The recombinant hLF-N (rhLF-N) protein was secreted into the culture medium at the level of $458{\mu}g/ml$ in 3 L fermentor. The size of purified hLF-N was estimated as 35 kDa when analyzed by SDS-PAGE and western blotting. The rhLF-N was further confirmed by immunodiffusion using the anti-hLF polyclonal antibody. The expression profile analysis by qRT-PCR showed that the relative mRNA expression of rhLF-N was maximal after 2-3 days of methanol induction and reduced gradually at 4 days. The purified rhLF-N showed broad antibacterial activities against the pathogens such as Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, and Salmonella typhimurium. However, rhLF-N showed relatively lower activity when compared to peptides derived from LF. In spite of this weak activity, the rhLF-N expressed in P. pastoris might be more advantageous for the industrial application, because rhLF-N is secreted into the culture medium and the production can also be increased by optimization of culture conditions.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 2014)으로서 이 또한 산업적 이용가능성과는 다소 거리가 있다. 이런 이유로 사람 유래의 hLF로 부터 N-lobe를 분리하여 항균활성을 확인하고 이를 메탄올자화 효모인 P. pastoris에서 대량 발현시켜 그 특성을 동정하고 LF 유래 펩타이드들과 항균활성을 비교한 본 연구는 N-lobe 의 산업적 이용을 위한 토대가 될 수 있을 것이다.

제안 방법

3’말단에 6x His-tag가 부착된 hLF-N 유전자를 pPIC9K 벡터의 제한효소 NotI 부위로 삽입하여 재조합 플라스미드 pPIC9K-hLfN을 제조하였다(Fig. 1A).
BMMY 배지에서 재조합 균주 SJ-HLNL을 배양한 후 4°C, 3,500 × g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후 12% SDS-PAGE로 분석하였다.
Halo assay를 위해서는 약 40 μg의 정제 hLF-N을 peptoneagar (1% peptone, 1.5% agar)에 각각 도말 된 병원성 균주 S. aureus ATCC 6538P, E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa KCCM 11802, B. cepacia ATCC 25416, S. typhimurium ATCC 14028 위에 점적하였다.
Western blotting은 Western Blue^R kit (Promega)를 사용하였으며 Sambrook 등(1989)의 방법에 따라 수행하였다. N-lobe를 탐지하기 위해서 mouse anti-6x His monoclonal antibody와 goat anti-mouse IgG (Fc)-alkaline phosphatase conjugate를 사용하였다. Alkaline phosphatase의 기질로는 4-nitrobluetetrazolium chloride (NBT)와 5-bromo-4- chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) (Thermo scientific Inc.
, 2011). P. pastoris의 염색체 DNA에 삽입된 플라스미드 DNA 는 AOX1 프로모터와 hLF-N 유전자 사이를 PCR로 증폭함으로써 확인하였으며, 이때 forward primer는 AOX1(F)를, reverseprimer는 AOXTT(R)을 사용하였다. 이렇게 만들어진 hLF-N을 발현하는 재조합 P.
이 두 primer는 모두 제한효소 NotI 서열을 포함하고 있으며, 특히 reverse primer는 6x His-tag가 삽입되어 있다. PCR에 의해 얻은 1.0 kb의 hLF-N DNA를 pPIC9K vector(Invitrogen)의 NotI 부위에 삽입하여 재조합 플라스미드 pPIC9K-hLfN을 제조하였다. 이 재조합 플라스미드를 제한효소 SalI으로 절단하여 선형으로 만든 후 P.
SJ-HLNL로부터 hLF-N의 발현 양상을 분석하기 위해 qRT-PCR을 실시하였다. Fig.
추출과정에서 오염된 genomic DNA는 RQI RNase- Free DNase (Promega)을 처리하여 제거하였다. cDNA 합성 반응은 DiaStarTM RT Kit (Solgent Co.)를 사용하였으며 제조사의 방법에 따라 반응시켰다. 간단히 보면 cDNA 합성은 1.
hLF-N 과 house-keeping 유전자인 actin cDNA의 합성을 위해서는 hLfN(R) primer와 actin cDNA(R) primer를 각각 사용하였다. cDNA 합성은 PCR에 의해 확인하였으며 이를 위해 hLfN(F) 와 hLfN(R) primer를 사용하였다. Actin cDNA의 합성을 확인하기 위해서는 actin(F)와 actin(R) primer를 사용하였다.
hLF-N 유전자를 α-factor 분비서열과 연결하고 AOX1 프로모터 하에 위치시켜 재조합 플라스미드 pPIC9K-hLfN을 만들고 이를 P. pastoris 염색체 DNA 속으로 삽입시켰다.
1A). hLF-N유전자의 삽입을 확인하기 위해서 primer AOX1(F)와 AOXTT(R)을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 그 결과 AOX1 프로모터에서 pPIC9K 벡터의 전사종결부위(TT)사이에 존재하는 1.
0이 되도록 첨가한 다음 본 배양을 시행하였다. hLF-N의 발현을 유도하기 위해서 본 배양 시작 48시간 후부터 120시간까지 매 24시간 마다 methanol을 최종농도 0.5% (v/v)가 되게 첨가하였다.
qRT-PCR은 25 μl의 USBⓇHotStart-ITⓇSYBRⓇGreen qRTPCR Master Mix (2x), 5 μl의 cDNA (1:5 희석), 1 μl의 각 primer (10 μM)를 포함하는 50 μl의 반응액을 MyiQTM SingleColor real-time PCR detection system (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 수행하였다.
재조합 사람 락토페린 N-lobe(rhLF-N)는 배양액으로 분비 발현되었으며, 3L 발효조에서 약 458 μg/ml이 수준으로 생성되었다. rhLF-N을 정제한 다음 SDS-PAGE와 western blot으로 분석하여 분자량 35 kDa 단백질을 확인하였으며, hLF에 대한 항체를 이용하여 면역확산법으로 면역성을 확인하였다. rhLF-N의 mRNA 발현양상을 qRT-PCR로 분석한 결과 메탄올 첨가에 의한 발현 유도 후 2-3일째에 발현율이 가장 높았으며, 4일째에는 점차적으로 감소하였다.
간략하게 보면 BMGY 배지에서 30°C에서 하룻밤 배양한 SJ-HLNL 종균을 원심분리하여 수획한 후, BMMY 배지를 OD600에서 1.0이 되도록 첨가한 다음 본 배양을 시행하였다.
)을 사용하여 dialysis 하였다. 그 후, 용액을 회수하여 동일한 조건으로 1 L의 증류수에서 각각 6시간, 12시간씩 두 번 더 dialysis하였다. 그 후 Dialyzed된 용액을 Pierce^Ⓡ Concentrator (MW cutoff: 20 kDa)을 사용하여 농축하였다.
락토페린(LF)의 항균 기능을 비롯한 다양한 생리적 기능에도 불구하고 산업적 측면에서 볼 때 LF 유래 펩타이드들은 크기가 너무 작아 배양이나 정제과정 등에서 손실이 크고, 반면에 완전한 형태의 LF나 hLF는 분자량이 너무 커서 배양 시 세포 외부로 분비가 쉽지 않다. 따라서 본 연구에서는 hLF 유래 N-lobe를 분리하여 클로닝하고, 메탄올자화 효모인 P. pastoris의 염색체 속으로 삽입한 후, 발현시켜 배양액으로 분비시킨 후 정제하여 항균활성을 측정하고 그 특성을 분석하였다.
Housekeeping 유전자로는 actin 유전자를 사용하였고, 결과는 2⌃-△△Ct 방법(Livak and Schmittgen, 2001)에 의해 분석하였다. 반복성 검증을 위해서 3번의 독립적인 실험을 수행하였다.
배양액을 수 획하여 분석한 결과 hLF-N은 약 458 μg/ml 이었다. 발현된 재조합 hLF-N을 Ni-NTA chromatography에 의해 정제하였다. Elution된 hLF-N 용액 속에 포함된 imidazole을 dialysis에 의해 제거하고, 이를 농축하여 총 68.
발현된 재조합 단백질의 세포 외분비를 위해서 hLF-N 유전자를 α-factor signal sequence와 연결하여 AOX1 프로모터 하에 위치하게 하였다.
락토페린(LF)는 철이온과 결합하는 당 단백질로서 항균, 항바이러스, 항진균 등의기능을 가지고 있으며, 생체의 각종 체액으로부터 분비되는 다기능성 단백질이다. 본 연구에서는 사람의 락토페린(hLF)으로부터 유래된 N-lobe의 유전자를 분리하고 산업용 균주로서 많이 사용되는 메탄올자화 효모인 Pichia pastoris에서 발현시켰다. 재조합 사람 락토페린 N-lobe(rhLF-N)는 배양액으로 분비 발현되었으며, 3L 발효조에서 약 458 μg/ml이 수준으로 생성되었다.
이 때, hLF-N의 증폭을 위해서는 qRT-N(F)와 qRT-N(R) primer를 사용하였으며 95°C, 1 min의 pre-denaturation 후, amplification은 95°C, 15 sec, 60°C, 15 sec, 72°C, 30 sec에서 총 40 cycle을 시행하였고 그 후, 72°C에서 1 min 동안1 cycle의 extension을 하였다.
가운데 구멍에는 rabbit anti-hLF antibody를 떨어뜨린 후 상온에서 하룻밤 방치하여 확산이 진행되게 하였다. 이 후 이를 coomassie blue로 염색하여 관찰하였다.
이를 37°C 항온기에서 하룻밤 배양한 다음, 나타나는 투명한 환(clear halo)을 관찰하였다.
재조합 N-lobe는 재조합 균주 SJ-HLNL을 배양하여 N-lobe의 발현을 유도한 다음, 상등액을 수획하여 QIAexpress^Ⓡ Kits (QIAgen Co.)를 사용하여 Ni-NTA affinity chromatography로 정제하였다. 먼저1 L의 SJ-HLNL 배양액을 Ultracel^Ⓡ 30 kDa Ultrafiltration Discs (Millipore)를 장착한 Stirred Ultrafiltration Cells Model 8200 (Millipore)를 사용하여 1/20으로 농축하였다.
재조합 hLF-N의 항균활성을 LF 유래 펩타이드들과 비교하였다. 펩타이드는 bovine LFcin 17-31, bovine LFampin 268-284, Hlopt2, HLSA를 사용하였다.
재조합 hLF-N의 항균활성을 분석하였다. 먼저 halo assay를 위해서는 약 40 μg의 정제된 hLF-N을 사용하였으며, 대상 균으로는 S.
재조합 균주 SJ-HLNL로부터 hLF-N을 발현하기 위하여 ‘재료및 방법’에 언급한 대로, 1 L의 BMMY 배지에서 5일 동안 배양한 후 methanol을 첨가하여 발현시켰다.
재조합 균주 SJ-HLNL로부터 total RNA를 kit (Real Biotech Co.)를 사용하여 추출하였다. 이 때 추출방법은 제조사의 방법에 따랐다.
발현된 재조합 단백질의 세포 외분비를 위해서 hLF-N 유전자를 α-factor signal sequence와 연결하여 AOX1 프로모터 하에 위치하게 하였다. 재조합 플라스미드 pPIC9K-hLfN을 제한효소 SalI으로 절단하여 선형으로 만든 후, 이를 P. pastoris SMD 1168의 염색체의 his4 위치로 single crossover에 의해 삽입 시켰다(Fig. 1A). hLF-N유전자의 삽입을 확인하기 위해서 primer AOX1(F)와 AOXTT(R)을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
이 때 추출방법은 제조사의 방법에 따랐다. 추출과정에서 오염된 genomic DNA는 RQI RNase- Free DNase (Promega)을 처리하여 제거하였다. cDNA 합성 반응은 DiaStarTM RT Kit (Solgent Co.
pastoris SMD 1168의 배양 상등액을 첨가한 뒤 나타난 colony수를 사용하였다. 항균 효과는 상대생존율로 나타내었으며, hLF-N이나 항균 펩타이드 첨가 후 나타난 colony수를 negative control에서 나타난 총 colony수로 나눈 백분율로 표시 하였다. 한편 positive control로는 kanamycin 150 μg을 첨가한 후 나타나는 colony수를 counting하여 사용하였다.

대상 데이터

cDNA 합성은 PCR에 의해 확인하였으며 이를 위해 hLfN(F) 와 hLfN(R) primer를 사용하였다. Actin cDNA의 합성을 확인하기 위해서는 actin(F)와 actin(R) primer를 사용하였다.
N-lobe를 탐지하기 위해서 mouse anti-6x His monoclonal antibody와 goat anti-mouse IgG (Fc)-alkaline phosphatase conjugate를 사용하였다. Alkaline phosphatase의 기질로는 4-nitrobluetetrazolium chloride (NBT)와 5-bromo-4- chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) (Thermo scientific Inc.)를 사용하였다.
pastoris SMD 1168은 hLF-N의 발현 숙주로 사용하였고 통상적으로 YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 배양하였다. BMGY 배지와 BMMY 배지는 P. pastoris에서 hLF-N의 발현에 사용하였다(Jo et al., 2011).
coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa KCCM 11802, Burkholderia cepacia ATCC 25416, Salmonella typhimurium ATCC 14028은 항균활성 측정 대상 균주로 사용하였다. P. pastoris SMD 1168은 hLF-N의 발현 숙주로 사용하였고 통상적으로 YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 배양하였다. BMGY 배지와 BMMY 배지는 P.
Table 1은 본 연구에 사용된 균주와 플라스미드를 나타낸다. Rabbit anti-hLF polyclonal antibody는 Sigma에서 구입하여 사용하였다. Mouse anti-His6 antibody는 IG Therapy Co.
에서 구입하였다. Western Blue^R kit는 Promega 에서 구입하였고 플라스미드 분리와 DNA 정제 kit는 QIAgen 으로부터 구입하였다. Total RNA 추출 kit와 DiaStar^TM RTase cDNA purification kit는 Real Biotech Co.
4 mM DTT, MuLV 역전사효소를 포함하는 1 μl DiaStar^TM RTase를 20 μl 의 반응액 속에 혼합한 후 50°C에서 60분 반응하였다. hLF-N 과 house-keeping 유전자인 actin cDNA의 합성을 위해서는 hLfN(R) primer와 actin cDNA(R) primer를 각각 사용하였다. cDNA 합성은 PCR에 의해 확인하였으며 이를 위해 hLfN(F) 와 hLfN(R) primer를 사용하였다.
coli TOP10F’은 플라스미드 형질전환 숙주로서 LB 배지에 배양하였으며, 필요 시 50 μg/ml의 ampicillin을 첨가하였다. 균주 Staphylococcus aureus ATCC 6538P, E. coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa KCCM 11802, Burkholderia cepacia ATCC 25416, Salmonella typhimurium ATCC 14028은 항균활성 측정 대상 균주로 사용하였다. P.
한편 positive control로는 kanamycin 150 μg을 첨가한 후 나타나는 colony수를 counting하여 사용하였다. 또한 hLF-N과 항균성을 비교하기 위해 항균 펩타이드인 bovine LFcin17-31, bovine LFampin 268-284, Hlopt2, HLSA 등을 사용하였다.
먼저 halo assay를 위해서는 약 40 μg의 정제된 hLF-N을 사용하였으며, 대상 균으로는 S. aureus ATCC 6538P, E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa KCCM 11802, B. cepacia ATCC 25416, S. typhimurium ATCC 14028가 사용되었다.
본 연구에서 제조된 재조합 균주 SJ-HLNL로부터 발현된 hLF-N은 세포 외로 분비되고 3 L jar fermenter에서 458 μg/ml 수준의 발현양을 보였다.
재조합 hLF-N의 항균활성을 LF 유래 펩타이드들과 비교하였다. 펩타이드는 bovine LFcin 17-31, bovine LFampin 268-284, Hlopt2, HLSA를 사용하였다. Fig.

이론/모형

이 때, hLF-N의 증폭을 위해서는 qRT-N(F)와 qRT-N(R) primer를 사용하였으며 95°C, 1 min의 pre-denaturation 후, amplification은 95°C, 15 sec, 60°C, 15 sec, 72°C, 30 sec에서 총 40 cycle을 시행하였고 그 후, 72°C에서 1 min 동안1 cycle의 extension을 하였다. Housekeeping 유전자로는 actin 유전자를 사용하였고, 결과는 2⌃-△△Ct 방법(Livak and Schmittgen, 2001)에 의해 분석하였다. 반복성 검증을 위해서 3번의 독립적인 실험을 수행하였다.
pastoris SJ-HLNL. Relative hLF-N mRNA was analyzed by the 2⌃-△△Ct method. Actin mRNA was used as house-keeping gene.
BMMY 배지에서 재조합 균주 SJ-HLNL을 배양한 후 4°C, 3,500 × g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후 12% SDS-PAGE로 분석하였다. Western blotting은 Western Blue^R kit (Promega)를 사용하였으며 Sambrook 등(1989)의 방법에 따라 수행하였다. N-lobe를 탐지하기 위해서 mouse anti-6x His monoclonal antibody와 goat anti-mouse IgG (Fc)-alkaline phosphatase conjugate를 사용하였다.
그 후 Dialyzed된 용액을 Pierce^Ⓡ Concentrator (MW cutoff: 20 kDa)을 사용하여 농축하였다. 단백질 농도는 Lowry법(1951)을 사용하여 정량하였다.
먼저1 L의 SJ-HLNL 배양액을 Ultracel^Ⓡ 30 kDa Ultrafiltration Discs (Millipore)를 장착한 Stirred Ultrafiltration Cells Model 8200 (Millipore)를 사용하여 1/20으로 농축하였다. 이 농축용액을 Ni-NTA affinity chromatography 를 이용하여 정제하였으며 이 때 방법은 제조사의 방법에 따랐다. 간단히 요약하면 30 ml의 elution buffer (50 mM NaH2PO4, 30 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.
)를 사용하여 추출하였다. 이 때 추출방법은 제조사의 방법에 따랐다. 추출과정에서 오염된 genomic DNA는 RQI RNase- Free DNase (Promega)을 처리하여 제거하였다.
재조합 hLF-N을 Ouchterlony double diffusion 분석법(1953)을 이용하여 면역학적으로 확인하였다. 간단히 기술하면, 4 ml의 0.
2A와 B는 각 각 정제된 hLF-N의 SDS-PAGE와 western blotting을 나타낸다. 정제된 재조합 hLF-N을 면역확산법에 의해 분석하였다. 재조합 hLF-N은 모유에서 정제된 hLF와 같이 anti-hLF polyclonal antibody에 반응하여 분명한 precipi tation line을 형성하였다(Fig.

성능/효과

rhLF-N을 정제한 다음 SDS-PAGE와 western blot으로 분석하여 분자량 35 kDa 단백질을 확인하였으며, hLF에 대한 항체를 이용하여 면역확산법으로 면역성을 확인하였다. rhLF-N의 mRNA 발현양상을 qRT-PCR로 분석한 결과 메탄올 첨가에 의한 발현 유도 후 2-3일째에 발현율이 가장 높았으며, 4일째에는 점차적으로 감소하였다. 정제한 rhLF-N을 이용하여 항균활성을 조사한 결과 Staphylococcus aureus, E.
결과에서 나타나는 것처럼 약 3 × 104개의 S. aureus를 50% 사멸시키는데 필요한 hLF-N의 농도 LD50은 약 100.6 μg/ml (약 2.85 mM) 이었다.
hLF-N유전자의 삽입을 확인하기 위해서 primer AOX1(F)와 AOXTT(R)을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 그 결과 AOX1 프로모터에서 pPIC9K 벡터의 전사종결부위(TT)사이에 존재하는 1.5 kb의 DNA가 나타났다(Fig. 1B). 이는 pPIC9KhLfN의 동일위치의 크기와 일치하였으며, 또한 이 DNA를 sequencing한 결과 염기서열이 hLF-N 유전자와 정확히 일치하였다(자료 미제시).
, 2006) 등이다. 또한 P. pastoris를 이용하여 많은 외부 단백질들이 발현되었고 산업화를 위한 효과적인 숙주로서 증명되었다.
만들어진 재조합 균주 SJ-HLNL로부터 hLF-N을 발현양상을 qRT-PCR을 이용하여 mRNA의 상대적인 발현양으로 분석한 결과, methanol 첨가에 의한 발현 유도후 2일과 3일째에 가장 높은 발현 빈도를 보였으며, 발현 유도 전에 비해서 약 1.4 × 103배의 급격한 발현증가를 보였다.
본 연구에서 발현한 재조합 hLF-N은 그람 양성균인 S. aureus 6538P, 그람 음성균인 E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa KCCM 11802, B. cepacia ATCC 25416, S. typhimurium ATCC 14028 등을 대상으로 한 항균 실험에서 광범위한 항균활성을 보였다. S.
비록 본 연구에서 발현한 hLF-N이 hLF 나 hLF로부터 유래된 여러 펩타이드들에 비해서 상대적으로 낮은 항균활성을 보이지만 대량생산이라는 산업적 측면에서 보면 오히려 유용한 점이 많은 것으로 생각된다. 첫째, 본 연구에서 발현된 hLF-N 은 배양 시에 세포 외로 분비되기 때문에 정제과정 등 생산 과정에 따른 수율향상, 제조 경비를 줄일 수 있고, 공정을 단순화 시킬 수 있으며, 둘째, hLF-N의 단백질 크기가 작기 때문에 방부제와 같은 특별한 목적으로 제제를 할 경우 안정성이나 활성유지 측면에서 보다 유리하기 때문이다.
2C). 이 결과는 재조합 균주 SJ-HLNL에 의해 발현된 hLF-N은 세포 밖으로 분비되어 배양액 속에 안정적으로 존재한다는 것을 나타낸다.
1B). 이는 pPIC9KhLfN의 동일위치의 크기와 일치하였으며, 또한 이 DNA를 sequencing한 결과 염기서열이 hLF-N 유전자와 정확히 일치하였다(자료 미제시). 이런 결과로 볼 때 hLF-N 유전자는 P.
이는 pPIC9KhLfN의 동일위치의 크기와 일치하였으며, 또한 이 DNA를 sequencing한 결과 염기서열이 hLF-N 유전자와 정확히 일치하였다(자료 미제시). 이런 결과로 볼 때 hLF-N 유전자는 P. pastoris의 his4 위치에 정확하게 삽입되었으며, 이 재조합 균주를 SJ-HLNL이라 명명하였다.
rhLF-N의 mRNA 발현양상을 qRT-PCR로 분석한 결과 메탄올 첨가에 의한 발현 유도 후 2-3일째에 발현율이 가장 높았으며, 4일째에는 점차적으로 감소하였다. 정제한 rhLF-N을 이용하여 항균활성을 조사한 결과 Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Salmonella typhimurium과 같은 병원성균에 대해 광범위한 항균활성을 보였으나, LF유래 항균 peptide들과 항균활성을 비교하였을 때, 항균력이 상대적으로 매우 떨어지는 것으로 나타났다. 비록 본 연구에서 발현한 rhLF-N은 항균력은 떨어지나, hLF에 비해 그 크기가 작고 배양조건 연구로 P.
비록 본 연구에서 발현한 hLF-N이 hLF 나 hLF로부터 유래된 여러 펩타이드들에 비해서 상대적으로 낮은 항균활성을 보이지만 대량생산이라는 산업적 측면에서 보면 오히려 유용한 점이 많은 것으로 생각된다. 첫째, 본 연구에서 발현된 hLF-N 은 배양 시에 세포 외로 분비되기 때문에 정제과정 등 생산 과정에 따른 수율향상, 제조 경비를 줄일 수 있고, 공정을 단순화 시킬 수 있으며, 둘째, hLF-N의 단백질 크기가 작기 때문에 방부제와 같은 특별한 목적으로 제제를 할 경우 안정성이나 활성유지 측면에서 보다 유리하기 때문이다. 이에 반해, 펩타이드들은 활성은 매우 높으나 크기가 작아 배양이나 정제과정에서 많은 손실이 생기게 되어 오히려 활용성이 떨어지는 단점이 있고, hLF는 분자량이 너무 커서 세포 외 분비나 활성 유지, 안정성 측면에서 오히려 불리한 점이 있을 수 있다.

후속연구

P. pastoris를 이용하여 돼지 LF를 발현하였을 때 약 12 μg/ml, S. cerevisiae를 이용하였을 때 약 1–1.5 μg/ml의 발현양이 보고 되었으나(Wang et al., 2002), 본 연구에서는 월등히 높은 hLF 발현양(약 38 배)을 보임으로써 산업적으로 이용하기가 보다 용이 할 것으로 사료된다.
, 2002), 본 연구에서는 월등히 높은 hLF 발현양(약 38 배)을 보임으로써 산업적으로 이용하기가 보다 용이 할 것으로 사료된다. 그러나 보다 높은 발현 양을 위해서는 배지최적화, 배양조건, 메탄올에 의한 발현 유도조건 등에 관한 자세한 연구가 필요하다. 무엇보다 재조합 P.
07) 보다 높기 때문에, 염기성 외에 다른 원인이 bactericidal activity에 영향을 끼치는 것으로 볼 수 있기 때문이다. 그러나 이에 관해서는 향후 보다 심도 있는 연구가 필요한 것으로 생각된다.
예를 들어 분자량의 크기 때문에 세포 외로 분비하기가 어려워 대량으로 생산하기가 쉽지 않다. 따라서 항균활성을 유지하면서 N-lobe를 분리하여 발현 할 수 있다면 이런 단점을 해소 할 수 있어 그 활용범위가 보다 다양해 질 수 있을 것이다. 이미 N-lobe를 분리 하여 클로닝하고 발현시킨 몇 개의 보고가 있다.
이에 반해, 펩타이드들은 활성은 매우 높으나 크기가 작아 배양이나 정제과정에서 많은 손실이 생기게 되어 오히려 활용성이 떨어지는 단점이 있고, hLF는 분자량이 너무 커서 세포 외 분비나 활성 유지, 안정성 측면에서 오히려 불리한 점이 있을 수 있다. 따라서, 항균활성이 유지되는 hLF-N의 발현 양을 증대시키면 향후 산업적 측면에서 보다 유용할 것으로 사료된다.
그러나 보다 높은 발현 양을 위해서는 배지최적화, 배양조건, 메탄올에 의한 발현 유도조건 등에 관한 자세한 연구가 필요하다. 무엇보다 재조합 P. pastoris를 이용하여 외부 단백질을 발현하고자 할 때 산소 요구량이 매우 높다고 알려져 있으므로 용존산소량(DO)에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요한 것으로 사료된다.
coli, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Salmonella typhimurium과 같은 병원성균에 대해 광범위한 항균활성을 보였으나, LF유래 항균 peptide들과 항균활성을 비교하였을 때, 항균력이 상대적으로 매우 떨어지는 것으로 나타났다. 비록 본 연구에서 발현한 rhLF-N은 항균력은 떨어지나, hLF에 비해 그 크기가 작고 배양조건 연구로 P. pastoris에서 대량 생산이 가능하며, 배양액으로 분비시킬 수 있기 때문에 정제 비용 등을 고려할 때 산업적 응용에는 보다 유리할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	사람 락토페린의 철 이온에 대한 높은 결합 친화력이 가지는 효과는?	또한 내재적 면역(innate immunity)의 일부로서 아주 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려졌으며, 이에 따라 박테리아, 곰팡이, 바이러스와 심지어 기생충에 의한 감염을 효과적으로 막는 숙주방어체계로서의 역할을 수행한다(Valenti and Antonini, 2005). hLF의 철 이온에 대한 높은 결합 친화력으로 말미암아 미생물이 자라는 환경으로부터 철 이온을 고갈시킴으로써 미생물의 생장을 억제(bacteriostatic)한다. 이와 같은 기작은 iron-free 상태의 apo-hLF가 철 이온과 결합하여 holo-hLF를 형성함으로써 가능한 것으로 알려져 있다(Day et al.
	사람 락토페린이란?	사람 락토페린(human lactoferrin, hLF)은 주로 초유에서 대량(약 7–8 g/L)으로 분비되는 단백질로서 양이온성(cationic)이며, 철과 결합하는 다기능성 당단백질이다. 또한 호중구, 혈장, 침, 눈물, 질액(vaginal fluid), 정액, 콧물, 위장관액과 같은 다양한 생체 내 용액에서도 검출 된다(Masson et al.
	사람 락토페린이 초유 외에 검출되는 곳은?	사람 락토페린(human lactoferrin, hLF)은 주로 초유에서 대량(약 7–8 g/L)으로 분비되는 단백질로서 양이온성(cationic)이며, 철과 결합하는 다기능성 당단백질이다. 또한 호중구, 혈장, 침, 눈물, 질액(vaginal fluid), 정액, 콧물, 위장관액과 같은 다양한 생체 내 용액에서도 검출 된다(Masson et al., 1966).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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