보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 Seoul National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2010-12 |
과제시작연도 |
2009 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201400026227 |
과제고유번호 |
1545001470 |
사업명 |
농림기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-11-14
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201400026227 |
초록
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IV. 연구개발결과
식물 바이러스 중 Reoviridae과의 Fijivirus속에 속하는 Rice black-streaked dwarf virus(RBSDV)는 동아시아에서 큰 피해를 발생시키는 maize wough dwarf disease와 벼검은줄오갈병의 원인 바이러스이다. RBSDV의 감염을 검출 및 진단하기 위하여 RT-PCR과 같은 분자생물학적 방법이 개발되기는 하였으나, 현장에서 대량으로 신속하게 진단하는 데에는 그 사용에 제한이 있기 때문에 특이항체를 이용하여 신속하고 효과적으로 RBSDV를 진단할 수 있는 진단
IV. 연구개발결과
식물 바이러스 중 Reoviridae과의 Fijivirus속에 속하는 Rice black-streaked dwarf virus(RBSDV)는 동아시아에서 큰 피해를 발생시키는 maize wough dwarf disease와 벼검은줄오갈병의 원인 바이러스이다. RBSDV의 감염을 검출 및 진단하기 위하여 RT-PCR과 같은 분자생물학적 방법이 개발되기는 하였으나, 현장에서 대량으로 신속하게 진단하는 데에는 그 사용에 제한이 있기 때문에 특이항체를 이용하여 신속하고 효과적으로 RBSDV를 진단할 수 있는 진단 키트의 개발이 필요하다. 이를 위하여 본 연구에서는 국내 분리주 RBSDV의 전체 게놈 염기서열을 결정하고 그로부터 12개의 유전자 구조를 분석하였다. RBSDV의 12개 유전자 중 ORF1, 2, 9 및 12는 각각 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), major core protein, core protein 및 major outer shell protein과 높은 상동성을 보였고, 이들은 바이러스의 복제나 구조에 필수적인 것으로 보고됨으로써 표지단백질로의 이용가능성이 가장 높을 것으로 추정되었다. 따라서 이들 유전자가 coding하는 단백질의 특이부분 및 전장단백질을 베큘로바이러스 발현벡터를 이용하여 다각체단백질과의 융합단백질의 형태로 발현시키거나 단독발현 시켰다.
이 중 단백질의 대량 발현 및 순수 분리가 잘 이루어진 ORF1 특이부분 및 ORF12 전장단밸질을 항원으로 실험동물에 주사하여 이들에 대한 특이항체를 제작하였으며, 항체의 민감성 및 특이성을 검정하였다. 이렇게 제작된 RBSDV 특이항체는 이 바이러스를 진단하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Rice stripe virus (RSV)는 대부분의 아시아 지역에서 벼에 큰 피해를 유발하는 벼줄무늬잎마름병의 원인 바이러스이며, 현장에서 이 바이러스를 진단할 수 있는 진단키트의 개발을 위하여 재조합단백질 및 합성 polypeptide를 항원으로 이용하여 RSV에 대한 항체를 제작하였다. 우선, 항체 재작을 위한 RSV 표지단백질을 선발하기 위하여 2008년과 2009년도에 국내에서 발생한 이병 벼로부터 다양한 RSV 변이주를 분리하고, 그로부터 RNA2 및 RNA3의 전체 게놈 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 바탕으로 계통관계를 분석한 결과 국내 분리주 RSV는 중국과 일본에서 보고된 RSV와 같은 계통에 속하는 것으로 나타났으며, 국내 분리주와 중국 및 일본 분리주 RSV 사이의 유전적 재조합 관계를 구명하기 위한 RT-PCR/Restriction enzyme 기법을 개발하였다.
생물정보학적 분석을 통하여 RNA2에 EcoRI과 RNA3에는 NdeI과 AseI 제한효소 위치가 있음을 확인하였으며, 이 기법을 이용하여 아시아 지역에서 분리된 RSV를 몇 개의 그룹으로 나눌 수 있었다.
재조합단백질의 발현을 위하여 RSV의 7개 단백질 중 게놈 염기서열 분석 결과를 바탕으로 NCP과 NS3 단백질을 선발하였다. NCP 및 NS3 단백질 유전자를 RT-PCR로 증폭한 후 His-tag를 포함하는 발현 벡터에 클로닝하고, E. coli를 이용하여 재조합단백질을 대량 발현한 후 His-gag를 이용하여 순수 분리하였다. 한편, RSV 단백질의 plypeptide 또한 합성하여 항체 제작을 위한 항원으로 사용하였다. 전체적으로 2개의 재조합단백질과 4개의 합성 polypeptide를 항원으로 토끼에 주사하여 6가지의 polyclonal 항체를 제작하였다. 2개의 재조합단백질 중 NCP에 대한 항체만이 Western blot에서 안정적으로 반응하였으며, 합성 polypeptide의 경우에는 CP와 NCP에 대한 항체가 이병 벼 및 잡초에서 RSV를 검출하는데 매우 효과적이었다. 본 연구를 통해서 RSV에 대한 특이항체를 성공적으로 제작하였으며, 이렇게 제작된 특이항체는 RSV의 진단, 면역침강, 단백질 정제 및 Western blot 등의 다양한 분석에 사용될 수 있을 것이다.
본 연구의 결과 제작된 RBSDV 및 RSV 특이항체를 이용하여 immuno-strip을 제작하기 위하여 crude serum에서 column을 이용하여 항체를 정제하였다. 최종적으로 정제된 항체 중에서 OD값이 가장 높은 것을 선택하여, 항체의 농도를 1 mg/ml로 맞춰서 gold conjugation에 사용하였다. Gold conjugate 실험 시, gold 입자에 적정한 ligand의 양을 결정하는 것이 중요하며, 일반적인 실험 결과가 양호하지 못하며 실험 I에서는 항체의 양을 20% 증가시켜 실험을 수행하였다. 그리고 gold solution의 pH를 보다 세분하여 테스트하였다. 위의 조건 실험의 결과, 테스트 line이 positive와 negative 모두 양성이 나오는 비특이 반응을 보였다. 이와 같은 현상을 보완하고자, 다른 조건은 모두 실험 I과 같게 하고 gold 용액과 antibody의 반응 시간만 30분에서 16시간으로 늘린 후 blocking buffer을 추가하였다. Gold conjugate solution을 흡수시켜서 말린 polyester 리본으로 immno-strip을 제작하여 테스트한 결과, 실험 I에서는 RBSDV와 RSV에서 모두 secondary line과 antibody line 모두에서 양성 반응이 나오는 비특이 반응을 보였다. 반면, 실험 II의 결과는 RBSDV와 RSV 각각 한 종류의 antibody에서 negative와 positive를 육안으로 판별할 수 있는 immuno-strip을 제작할 수 있었다. 차후 gold conjugate의 감도를 높이기 위한 실험이 추가 보완된다면, immuno-strip의 제품화 및 대량 생산이 가능할 것으로 판단된다.
Abstract
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Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV), a member of the genus Fijivirus within the family Reoviridae, is the causative agent of maize rough dwarf and rice black-steaked dwarf diseases, both of which can lead to severe yield losses in east Asia. Although molecular approaches such as RT-PCR have pote
Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV), a member of the genus Fijivirus within the family Reoviridae, is the causative agent of maize rough dwarf and rice black-steaked dwarf diseases, both of which can lead to severe yield losses in east Asia. Although molecular approaches such as RT-PCR have potential for detection and diagnosis of this virus infections, their impact on high throughput certification is still limited. Therefore, the development of an antibody-based assay for rapid and effective diagnosis of RBSDV is preferable. In this study, we collected RBSDV from rice with rough dwarf disease and its complete nucleotide sequences of 10 genomic segments encoding 12 non-overlapping ORTs were determined. Among 12 ORFs, ORF1, 2, 9 and 12 showed high level of similarities with the RdRp, major core protein, core protein and major outer shell protein, respectively. These ORFs were expressed as polyedrin fusion protein or full-lenght soluble protein using baculovirus expression system for the preparation of specific antibody against RBSDV, which could be useful for the detection and diagnosis of this virus.
Rice stripe virus (RSV) is one of serious epidemic pathogens for rice species grown in mostly Asia. Therefore, it is necessary to produce a diagnostic detection kit aplicable in fields for RSV detection. For that, antibodies for RSV were generated on the basis of recombinant protein and synthetic polypeptedis as antigens. In prior to select RSV proteins for anti-body production, we first screened various RSV isolates from the RSV infected rice plants during 2008 and 2009 in Korea. And then, we analyzed whole genome sequences of RNA2 and RNA3 for collected Korean RSV isolates. Based on complete nucleotide sequences of RNA2 and RNA3, phylogenetic tree was constructed showing that the Korean RSV isolates were grouped together with RSV isolates derived from China and Japan. Firthermore, we development RT-PCR/Restriction enzyme technique to reveal the genetic recombination between Korean RSV isolates and Chinese or Japanese RSV isolates. Bioinformatic analysis identified specific enzyme sites in RNA2 (EcoR 1) and RNA3 (Nde 1 and Ase 1). Using newly developed RT-PCR/Restriction enzyme technique, we could divide the Asian RSV isolates into several groups. Based on genome sequence data, we selected two proteins (NCP and NS3 proteins) among seven proteins in RSV for production of recombinant proteins. Genes encoding NCP and NS3 proteins were cloned into the expression vector carrying His-tag after RT-PCR amplification. Consequently, we obtained purified His-tagged recombinant proteins which were produced in E. coli. Altermately, we also applied synthetic polypeptides of RSV proteins which are suitable to raise antiserum for antibody production. A total of six polyclonal antibodies consisted of two recombinant proteins and four synthetic polypeptides were raised in rabbits. Of two recombinant proteins, only anti-NCP displayed stable hybridization signals in western blot analysis. In case of synthetic polypeptides, antibodies for CP and NCP were very effective to detect RSV in both RSV infected rice and weed plants. However, antibodies for NS3 and NSvc4 showed weak specific bands aas well as strong non-specific background. In summary, the antibodies successfully generated for RSV in this study can be practically applied for vatious assays such as RSV diagnostic detection, immunoprecipitation, protein purification, and western blot analysis.
To get the specific antibody from crude serum, column chromatography was preformed. First, desalting from crude serum, second, separating the specific antibody from crude serum, third, desalting of purified antibody. We selected the best one which had highest OD value and adjusted it, 1 mg/ml. We did focused on adjusting proper amount of ligand. However the result of the tests was not that good, so we added 20% more antibody to the test. And we tested the various range of pH to set.
When we performed the experiment after setting in detail, we got a nonspecific response, showing positive response from both of positive sample and negative sample. To correct this, we took more reaction time (from 30 min to 16 h) for gold-antibody conjugation and added blocking buffer. We tested immuno-strip manufacturing with polyester ribbon which was dried after absorbing gole conjugate solution. We got a non-specific result from first experiment from RBSDV and RSV. It showed positive reaction both secondary line and antibody line. However, we got a specific result from second experiment from RBSDV and RSV which showed a remarable contrast between negative and positive samples. If we set more details by several experiments, we could make commercial production.
목차 Contents
- 표 지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- SUMMARY ... 8
- CONTENTS ... 10
- 목 차 ... 11
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 13
- 제1절 연구개발의 목적 ... 13
- 제2절 연구개발의 필요성 ... 13
- 제3절 연구개발의 내용 및 범위 ... 14
- 1. 연구개발의 목표 ... 14
- 2. 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 14
- 3. 연구추진 내용 및 계획 ... 15
- 가. 연구추진 전략 ... 15
- 나. 연구개발 내용 ... 15
- 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 17
- 제1절 국내 기술현황 ... 17
- 제2절 국외 기술현황 ... 17
- 제3절 기술개발의 파급효과 및 금후의 전망 ... 18
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19
- 제1절 벼 바이러스 항체 대량 생산 ... 19
- 제2절 벼 바이러스 특이항체 생산용 고효율 유전자 선발 ... 40
- 제3절 Immuno-strip 제작 및 특이성 평가 ... 54
- 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 71
- 제1절 연구개발 목표와 평가의 착안점 ... 71
- 1. 연차별 연구개발의 목표 ... 71
- 2. 연구평가의 착안점 ... 71
- 제2절 연구개발 목표의 달성도 ... 72
- 제3절 연구개발의 관련분야 기여도 ... 74
- 1. 기술적 측면 ... 74
- 2. 경제·산업적 측면 ... 74
- 제5장 연구개발 성과 및 활용계획 ... 75
- 제1절 정량적 성과 ... 75
- 제2절 연구결과의 활용계획 ... 76
- 제3절 추가연구의 필요성 ... 76
- 제4절 타연구에의 응용성 ... 77
- 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 78
- 제7장 참고문헌 ... 79
- 끝페이지 ... 82
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