초록 ▼

○ 연구결과
KNF2016균주의 산업용 배지선발 및 pilotscale발효 최적화가 완료되었으며,경제성이 확보된 액상제형용 후처리 공정의 확립과 이에 부합되는 액상제형용 처방이 확립되었다.상기 조건으로 생산된 원제와 제품의 위해성 평가 결과 인축 및 환경에 매우 안전한 제품으로 판명되었다.활성물질의 분리정제과정을 거쳐 특정 단백질 수준까지 밝혀진 바 있으며,관련 유전자 knock-out균주 선발이 완료되어 유전자군까지의 탐색이 완료되었다.활성물질과 연계된 지표물질을 선발하여 이를 활용한 Q.C법을 확립하였다.항바이러스 활성의

○ 연구결과
KNF2016균주의 산업용 배지선발 및 pilotscale발효 최적화가 완료되었으며,경제성이 확보된 액상제형용 후처리 공정의 확립과 이에 부합되는 액상제형용 처방이 확립되었다.상기 조건으로 생산된 원제와 제품의 위해성 평가 결과 인축 및 환경에 매우 안전한 제품으로 판명되었다.활성물질의 분리정제과정을 거쳐 특정 단백질 수준까지 밝혀진 바 있으며,관련 유전자 knock-out균주 선발이 완료되어 유전자군까지의 탐색이 완료되었다.활성물질과 연계된 지표물질을 선발하여 이를 활용한 Q.C법을 확립하였다.항바이러스 활성의 극대화를 위한 바이러스병 발병생태 및 이를 평가할 수 있는 시스템의 확립을 이루었다.생산되어진 원제 및 제품을 이용하여 화학농약과의 혼용성 및 약효 안정성을 분석한 결과 대부분의 약제와 혼용이 가능하며,항바이러스 활성에도 별다른 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.또한 개발된 식물바이러스 방제제는 꿀벌,서양뒤영벌,무당벌레와 같은 유용곤충에 대해서도 매우 안전한 것으로 평가되었다.

Abstract ▼

Optimized industrial culture compositions for Pseudomonas oleovorans KCTC10159BP (referred to below as KNF2016) was selected as follows (Yeast extract 2%, KH₂PO₄ 0.5%, K₂HPO₄ 0.1%, MgSO₄·7H₂O 0.02%, MnSO₄·5H₂O 0.

Optimized industrial culture compositions for Pseudomonas oleovorans KCTC10159BP (referred to below as KNF2016) was selected as follows (Yeast extract 2%, KH₂PO₄ 0.5%, K₂HPO₄ 0.1%, MgSO₄·7H₂O 0.02%, MnSO₄·5H₂O 0.05%). Mass culture process was established from 5L jar fermenter to 5,000L pilot fermenter. 5,000L pilot sample showed antiviral effect more than 90% at dilution rate 1/500. KNF2016 technical kept stable antiviral activity at temperature range 60 ∼ 100℃ and aging test(54℃). Post processing for liquid type formulation was established in order to ensure economic feasibility and effectiveness. Adjuvant for extension of shelf life was selected through the establishment of more reliable and accurate bioassay. Control values of liquid type formulation product (KNF2016 70%AS) were 94.6% and 90.9% at dilution rate of 1/500 and 1/1,000, respectively.
RT25 values of KNF2016 technical at standard application were <1 day against honeybee, <1 hour against bumblebee, and <1 day against ladybug.
Compatibilities of KNF2016 technical were evaluated with 29 insecticides for horticulture on 5 crops and 91 fungicides for horticulture on 8 crops.
KNF2016 70% AS showed good efficacy against TYLCV and CGMMV in 2 year field trials for registration. These results suggested KNF2016 70% AS has a practical value for contol of TYLCV and CGMMV.
As a result of separation by using techniques based on solubility and molecular weight, active materials showing antiviral activity were confirmed as three different proteins having molecular weight of 51KDa, 45KDa, and 40KDa, respectively.
N-terminal sequences of No. 2 and 3 band at SDS-PAGE were identified as Asp - Ile - Asn - Gly - Gly. Amino acid compositions of No. 2 band were Glycine (19.46%), Phenylalanine (16.45%), and Threonine (8.53%).
Through antiviral activity assay against 641 mutants by random mutagenesis, 7 mutant clones (4C1, 4C2, 4F3, 4F5, 4H11, 5B7, 5C7 ) were selected due to decreased antiviral activity and their knock-out gene sequences were analyzed.
Since production yield of antiviral material was increased in partly proportion to cell number, fatty acids increased by cell growth were analyzed by GC/MS as index material. Oleic acid (C18:1) was identified as index material and its content was 18.7㎍/㎖. Another approach for quality control was to measure protein band intensity at SDS-PAGE, but this method was not suitable due to difficulty of quantitative analysis.
Rice yield was increased as RSV disease rate was decreased. Suppression effect of test materials against RSV pathogenesis in paddy field was significantly different according to day after treatment. Especially, resistance against RSV was maintained during 5 days after treatment. Antiviral effect against RSV was quantitative evaluated by using technique of spray application at insect vector and seedling bioassay. Both test materials showed significantly different antiviral efficacies. Residual effect by single application of KNF2016 70% AS was maintained for 13.4 days.
In case of aphid, consistency of pathogenesis rate by inoculation time was not measured and its efficacy could not be evaluated quantitatively by pharmacological reaction kinetics model. therefore, additional technical development is required for evaluation of antiviral effect against non-persistent virus. In order to examine the optimized application method, paddy field trials against RSV were performed in Seo-san and Yang-pyeong. But these trials were not suitable for evaluation of efficacy due to too low pathogenesis rate at untreated plot. Nevertheless, as suppression effect against RSV pathogenesis was observed at KNF2016 70% AS treatment plot, more studies are required. further studies are required for establishment of application method against RSV.
In acute toxicity studies, KNF2016 technical showed low oral and dermal toxicity.
KNF2016 technical was also classified as not irritant to skin and eye. It is not a skin sensitizer. Mutagenicity studies did not reveal any signs of toxicity. NOEAL(No Observed Adverse Effect Level) in 28-day rat study was 1,000mg/kg/day and 90-day rat study is in progress. In acute toxicity studies to Daphnia, algae and fish, all NOEC were ≥100mg/L. All LD50 in acute oral and contact toxicity studies to honeybees were >100㎍ a.i./bee at 24H and 48H after application.
In acute toxicity studies, KNF2016 70%AS showed low oral and dermal toxicity.
KNF2016 70%AS was also classified as mild irritant to skin and eye. It is not a skin sensitizer. In acute toxicity studies to carp, NOEC was ≥10mg/L. EC50 of KNF2016 70%AS in acute Immobilisation test to Daphnia were 32.0mg/L and 13.6mg/L at 24H and 48H after application, respectively.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 29
• CONTENTS ... 31
• 목차 ... 36
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 44
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 49
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 51
• 제 1 절 연구개발 수행 내용 ... 51
• 1. 활성물질의 대량생산 공정개발 및 제형화 ... 51
• 가. 산업용 배지 최적화 및 배양최적화 ... 51
• (1) 공시균주 ... 51
• (2) 배지 조성 변경 ... 51
• (3) 무기염 선발 ... 51
• (4) 5L jar fermenter 배양 최적화 ... 51
• (5) 500L pilot fermenter 배양 최적화 ... 51
• (6) 5,000L pilot fermenter 배양 최적화 ... 52
• (7) 5,000L pilot 생산시료의 Q. C ... 52
• 나. 후처리 공정별 가능 제형선발 ... 52
• (1) KNF2016 원제의 특성연구 ... 52
• (가) 열안전성 시험 ... 52
• (나) 경시안정성 시험 ... 52
• (다) 부제 선발 시험 ... 52
• (2) 후처리 공정 개발 및 최적화 ... 52
• (가) 액상제형용 후처리 공정 개발 ... 52
• (나) 균주사멸 공정 검토 ... 53
• (다) 배양액 농축 공정 검토 ... 53
• (라) 후처리 공정 최적화 ... 53
• (3) 제제화 연구 ... 53
• (가) 생물검정법 확립 ... 53
• (나) 유효기간 연장용 부제 선발 ... 53
• (다) 선발된 부제의 경시안정성 시험 ... 54
• 다. 시제품 생산 ... 54
• (1) 포장 및 안전성 시험용 원제생산 ... 54
• (2) 시제품 생산 및 안정성 분석 ... 54
• (가) 시제품 생산용 시료의 배양 ... 54
• (나) 시제품 생산용 액상원제의 생물검정 ... 54
• (다) 시제품 제조용 처방 ... 54
• (라) 시제품의 경시안정성 ... 54
• 라. 유용곤충에 대한 영향평가 ... 55
• (1) 꿀벌에 대한 영향 평가 ... 55
• (2) 서양뒤영벌에 대한 영향평가 ... 55
• (3) 무당벌레에 대한 영향평가 ... 55
• 마. 화학농약에 대한 영향평가 ... 55
• (1) 화학농약과의 혼용성 평가 ... 55
• (가) 원예용 살충제 혼용성 평가 ... 55
• (나) 원예용 살균제 혼용성 평가 ... 55
• (2) 혼용 약효 영향성 평가 ... 56
• 바. 포장시험 검정 ... 56
• (1) 토마토 황화잎말림병 ... 56
• (2) 수박 얼룩모자이크병 ... 56
• 사. 등록시험 ... 56
• (1) 1년차 포장시험 ... 56
• (가) 토마토 황화잎말림병 ... 56
• (나) 수박 얼룩모자이크병 ... 56
• (2) 2년차 포장시험 ... 57
• (가) 토마토 황화잎말림병 ... 57
• (나) 수박 얼룩모자이크병 ... 57
• 2. 활성물질의 대량 순화 및 활성유전자 탐색 ... 58
• 가. 대량 순화과정의 산업화를 위한 활성검정 기반 추출물 분획 scheme 확립 ... 58
• (1) 항바이러스 미생물의 배양 ... 58
• (가) 배지 ... 58
• (나) 배양조건 ... 58
• (2) 항바이러스 물질의 순화 ... 58
• (가) 균체의 파쇄 및 항바이러스 물질 추출 ... 58
• (나) 용해도에 따른 활성물질의 분리 ... 58
• (다) Bio-Gel P10을 이용한 분자량에 따른 활성물질의 분리 ... 59
• (라) Bio-Gel P60을 이용한 분자량에 따른 활성물질의 분리 ... 59
• 나. 항바이러스 물질의 특성분석 ... 59
• (1) 항바이러스 물질의 특성분석 ... 59
• (가) 활성물질의 아미노산 서열 분석 ... 59
• (나) 활성물질의 아미노산 조성 분석 ... 59
• 다. 활성물질의 활성유전자 탐색 ... 60
• (1) 항바이러스 활성 균주의 genomic DNA library 제작 ... 60
• (가) Genomic DNA purification ... 60
• (나) Fosmid library 제작 ... 60
• (2) 항바이러스 활성물질의 유전자 탐색 ... 61
• (가) Specific protein을 암호화하는 유전자 탐색 ... 61
• (나) Random mutation을 통한 활성유전자 탐색 ... 62
• 라. Quality Control을 위한 검정법 확립 ... 63
• (1) 지방산 분석을 이용한 Q. C 법 검토 ... 63
• (2) SDS-PAGE를 이용한 Q. C 법 검토 ... 64
• 마. 곤충 매개 바이러스의 특성 및 농가적용법 연구 ... 64
• (1) 바이러스 매개충의 보독충율 및 병 발생 모니터링 기술 개발 ... 64
• (가) 매개충의 보독충율 및 병 발생 모니터링 ... 64
• (2) 충매 바이러스의 발병특성에 따른 약효 평가 기술 개발 ... 64
• (가) 병저항성 검정기술을 활용한 항바이러스 약효 검정 ... 65
• (나) 약리반응속도론 모델을 적용한 항바이러스성 약효 검정 기술 개발 ... 66
• (3) 활성물질의 적용스펙트럼 확보 및 농가적용법 연구 ... 67
• (가) CMV에 대한 항바이러스 약효 검정을 위한 약리반응속도론 모델의 적용 ... 68
• (나) RSV에 대한 농가적용법 연구 ... 68
• 3. KNF2016의 안전성 평가 ... 69
• 가. KNF2016 원제에 대한 안전성평가 ... 69
• (1) SD계 랫드에 대한 급성경구독성시험 ... 69
• (2) SD계 랫드에 대한 급성경피독성시험 ... 69
• (3) New Zealand White계 토끼에 대한 피부자극성시험 ... 69
• (4) New Zealand White계 토끼에 대한 안점막자극성시험 ... 70
• (5) 기니 픽에 대한 피부감작성시험 ... 70
• (6) 미생물복귀 돌연변이시험 ... 70
• (7) 소핵시험 ... 71
• (8) 염색체이상시험 ... 71
• (9) 반복투여독성시험(rat) ... 72
• (10) 물벼룩(Daphnia magna)에 대한 급성유영저해시험 ... 73
• (11) 녹조류(Pseudokirchneriella subcapitata)에 대한 성장저해시험 ... 73
• (12) 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 급성어독성시험 ... 73
• (13) 꿀벌(Apis mellifera)에 대한 급성섭식독성시험 ... 73
• (14) 꿀벌(Apis mellifera)에 대한 급성접촉독성시험 ... 73
• 나. KNF2016 70% AS (제품)에 대한 안전성평가 ... 74
• (1) ICR계 마우스에 대한 급성경구독성시험 ... 74
• (2) SD계 랫드에 대한 급성경피독성시험 ... 74
• (3) New Zealand White계 토끼에 대한 피부자극성시험 ... 74
• (4) New Zealand White계 토끼에 대한 안점막자극성시험 ... 74
• (5) 기니 픽에 대한 피부감작성시험 ... 74
• (6) 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 급성어독성시험 ... 75
• (7) 물벼룩(Daphnia magna)에 대한 급성유영저해시험 ... 75
• 제 2 절 연구개발 수행 결과 ... 76
• 1. 활성물질의 대량생산 공정개발 및 제형화 ... 76
• 가. 산업용 배지 최적화 및 배양최적화 ... 76
• (1) 배지 조성 변경 ... 76
• (2) 무기염 선발 (Flask 검정) ... 76
• (3) 5L jar fermenter 배양 최적화 ... 77
• (4) 500L pilot fermenter 배양 최적화 ... 79
• (5) 5,000L pilot fermenter 배양 최적화 ... 80
• (6) 5,000L pilot 생산시료의 Q. C ... 81
• 나. 후처리 공정별 가능 제형선발 ... 81
• (1) KNF2016 원제의 특성연구 ... 81
• (가) 열안전성 시험 ... 81
• (나) 경시안정성 시험 ... 82
• (다) 부제 선발 시험 ... 82
• (2) 후처리 공정 개발 및 최적화 ... 83
• (가) 액상제형용 후처리 공정 개발 ... 83
• (나) 균주사멸 공정 검토 ... 84
• (다) 배양액 농축 공정 검토 ... 85
• (라) 후처리 공정 최적화 ... 86
• (3) 제제화 연구 ... 86
• (가) 생물검정법 확립 ... 86
• (나) 유효기간 연장용 부제 선발 ... 89
• (다) 선발된 부제의 경시안정성 시험 ... 90
• 다. 시제품 생산 ... 90
• (1) 포장 및 안전성 시험용 원제생산 ... 90
• (2) 시제품 생산 및 안정성 분석 ... 91
• (가) 시제품 생산용 시료의 배양 ... 91
• (나) 시제품 생산용 액상원제의 생물검정 ... 92
• (다) 시제품 제조용 처방 ... 92
• (라) 시제품의 경시안정성 ... 93
• 라. 유용곤충에 대한 영향평가 ... 94
• (1) 꿀벌에 대한 영향 평가 ... 94
• (2) 서양뒤영벌에 대한 영향평가 ... 96
• (3) 무당벌레에 대한 영향평가 ... 98
• 마. 화학농약에 대한 영향평가 ... 101
• (1) 화학농약과의 혼용성 평가 ... 101
• (가) 원예용 살충제 혼용성 평가 ... 101
• (나) 원예용 살균제 혼용성 평가 ... 102
• (2) 혼용 약효 영향성 평가 ... 103
• 바. 포장시험 검정 ... 106
• (1) 토마토 황화잎말림병 ... 106
• (2) 수박 얼룩모자이크병 ... 107
• 사. 등록시험 ... 108
• (1) 1년차 포장시험 ... 108
• (가) 토마토 황화잎말림병 ... 108
• (나) 수박 얼룩모자이크병 ... 109
• (2) 2년차 포장시험 ... 110
• (가) 토마토 황화잎말림병 ... 110
• (나) 수박 얼룩모자이크병 ... 111
• 2. 활성물질의 대량 순화 및 활성유전자 탐색 ... 113
• 가. 대량 순화과정의 산업화를 위한 활성검정 기반 추출물 분획 scheme 확립 ... 113
• (1) 용해도에 따른 활성물질의 분리 ... 113
• (2) 분자량에 따른 활성물질의 분리 ... 113
• 나. 항바이러스 활성물질의 특성분석 ... 117
• (1) 활성물질의 아미노산 서열 분석 ... 117
• (2) 활성물질의 아미노산 조성 분석 ... 118
• 다. 항바이러스 활성물질의 유전자 탐색 ... 119
• (1) Specific protein을 암호화하는 유전자의 탐색 ... 119
• (2) Random mutagenesis를 이용한 유전자의 탐색 ... 121
• 라. Quality Control을 위한 검정법 확립 ... 123
• (1) 지방산 분석을 이용한 Q. C 법 검토 ... 123
• (2) SDS-PAGE를 이용한 Q. C 법 검토 ... 124
• 마. 곤충 매개 바이러스의 특성 및 농가적용법 연구 ... 125
• (1) 바이러스 매개충의 보독충율 및 병 발생 모니터링 기술 개발 ... 125
• (가) 매개충의 보독충율 및 병 발생 모니터링 ... 125
• (2) 충매 바이러스의 발병특성에 따른 약효 평가 기술 개발 ... 127
• (가) 병저항성 검정기술을 활용한 항바이러스 약효 검정 ... 127
• (나) 약리반응속도론 모델을 적용한 항바이러스성 약효 검정 기술 개발 ... 131
• (3) 활성물질의 적용스펙트럼 확보 및 농가적용법 연구 ... 133
• (가) CMV에 대한 항바이러스 약효 검정을 위한 약리반응속도론 모델의 적용 ... 133
• (나) RSV에 대한 농가적용법 연구 ... 135
• 3. KNF2016의 안전성 평가 ... 137
• 가. KNF2016 원제에 대한 안전성평가 ... 137
• (1) SD계 랫드에 대한 급성경구독성시험 ... 137
• (2) SD계 랫드에 대한 급성경피독성시험 ... 137
• (3) New Zealand White계 토끼에 대한 피부자극성시험 ... 138
• (4) New Zealand White계 토끼에 대한 안점막자극성시험 ... 139
• (5) 기니 픽에 대한 피부감작성시험 ... 141
• (6) 미생물복귀 돌연변이시험 ... 142
• (7) 소핵시험 ... 146
• (8) 염색체이상시험 ... 148
• (9) 반복투여독성시험(rat) ... 149
• (10) 물벼룩(Daphnia magna)에 대한 급성유영저해시험 ... 154
• (11) 녹조류(Pseudokirchneriella subcapitata)에 대한 성장저해시험 ... 155
• (12) 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 급성어독성시험 ... 155
• (13) 꿀벌(Apis mellifera)에 대한 급성섭식독성시험 ... 156
• (14) 꿀벌(Apis mellifera)에 대한 급성접촉독성시험 ... 156
• 나. KNF2016 70% AS (제품)에 대한 안전성평가 ... 156
• (1) ICR계 마우스에 대한 급성경구독성시험 ... 156
• (2) SD계 랫드에 대한 급성경피독성시험 ... 157
• (3) New Zealand White계 토끼에 대한 피부자극성시험 ... 157
• (4) New Zealand White계 토끼에 대한 안점막자극성시험 ... 158
• (5) 기니 픽에 대한 피부감작성시험 ... 159
• (6) 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 급성어독성시험 ... 159
• (7) 물벼룩(Daphnia magna)에 대한 급성유영저해시험 ... 159
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 161
• 제 1 절 목표 달성도 ... 161
• 제 2 절 관련 분야에의 기여도 ... 164
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 168
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 169
• 제 7 장 참고문헌 ... 172
• 끝페이지 ... 175