초록 ▼

○ 연구결과
검정옥수수의 Polyphenol분리/분석 및 invitro항당뇨 및 당뇨합병증 억제능 평가
1)LC-MS/MS를 이용한 안토시아닌 성분 분석 및 HSCCC를 이용한 주요성분 분리
▪ HighSpeedCounter-CurrentChromatography(HSCCC)로 주요 안토시아닌 성분을 분리하여 활성 검정 및 각 세부과제에 주요 성분 분양.
▪ 검정옥수수 함유 주요 안토시아닌 성분은 cyanidin-3-glucoside(1),pelargonidin-3-glucoside(2), peonidin-3-

○ 연구결과
검정옥수수의 Polyphenol분리/분석 및 invitro항당뇨 및 당뇨합병증 억제능 평가
1)LC-MS/MS를 이용한 안토시아닌 성분 분석 및 HSCCC를 이용한 주요성분 분리
▪ HighSpeedCounter-CurrentChromatography(HSCCC)로 주요 안토시아닌 성분을 분리하여 활성 검정 및 각 세부과제에 주요 성분 분양.
▪ 검정옥수수 함유 주요 안토시아닌 성분은 cyanidin-3-glucoside(1),pelargonidin-3-glucoside(2), peonidin-3-glucoside(3),cyanidin-3-(6"-malonylglucoside)(4),pelargonidin-3-(6"-malonylglucoside)
(5),cyaniding-3-(dimalonylglucoside)(6),cyanidin 3-(6-acetylglucoside)(7),peonidin-3-(6"-malonylglucoside)(
8)규명
2)Non-anthocyanin성분 분리 및 구조규명
▪prothocatechuicacid (1),vanillicacid(2),2,4,6-trihydroxy benzoicacid (3),p-hydroxycinnamic acid(4),ferulicacid(5),hirsutrin(6),3`-methoxyhirsutrin(7)규명
3)활성평가 -분리된 anthocyanin,polyphenol성분을 대상으로 당뇨,항당뇨합병증 효능을 평가
▪당뇨 및 합병증 억제능 평가를 실시하여 3종의 우수활성
▪당뇨:polyphenol성분 중에서 3`-methoxyhirsutrin물질에서 우수한 활성을 보임
▪당뇨합병증:anthocyanin 성분 중에서 cyanidin-3-(6-malonyl-glucoside)물질에서 우수한 활성을 보였음. polyphenol성분 중에서 hirsutrin물질에서 우수한 활성을 보임.
4)우수 활성을 갖는 검정옥수수 종을 선발하기 위해 기초 활성 시험을 통한 우수종 선발
▪강원도 옥수수시험장으로부터 검정옥수수를 분양받아 (3차)우수종을 선발하여 최종 5종의 색찰교를 확정하여 대량생산을 위한 품종신고 전까지 연구 진행하였음.
5)추출,분획 및 고수율 추출 조건 확립
▪반응표면 분석법(ResponseSurfaceMethodology)을 이용하여 최적의 추출조건을 확립
▪추출온도(℃)는 40~60℃,추출시간(hr)은 7.5~9.0시간,추출 용매의 농도(%)는 32~34%,추출 용매의 비율은 1:12~1:15의 비율 -추출 수율,총 폴리페놀 함량 및 총 안토시아닌 함량이 높게 나옴
6)HSCCC (High speedcounter-currentchromatography)를 이용하여 대량추출법을 확립하고 세부 과제에 활성성분을 분양
7)캡슐 시제품 제작하였음
검정옥수수의 polyphenol의 췌장베타세포 보호 및 재생 활성 분석 및 활용연구
1)검정옥수수 polyphenol의 췌장 베타세포 보호활성 및 기전을 2형 당뇨모델인db/dbmouse분석
▪2형 당뇨모델인db/dbmouse에 검정옥수수 polyphenol을 7주간 섭취시키고,혈당,insulin,당화혈색소,경구당내성을 분석한 결과 현재 처방되고 있는 Glimepiride보다 모든 면에서 우수한 것으로 나타났음
2)췌장에서 ROS(활성산소),세포사,세포성장 및 세포사 관련 단백질 분석
▪췌장 베타세포 박편을 anti-insulin antibody로 염색한 결과 검정옥수수 polyphenol을 섭취시킨 db/db mouse에서는 베타세포가 죽지 않고 살아있었고 대조군이나 Glimepiride처리군에서는 베타세포가 많이 죽어있는 것을 발견하여 검정옥수수 polyphenol이 췌장 베타세포 보호효과가 우수하다는 것을 발견하였음
3)마우스에서 기초 독성 검사
▪2형 당뇨모델인 db/db mouse에 Purple Corn Polyphenols (10mg/kg/day)을 경구로 7주간 투여 후에 행동양상 관찰, 각 장기의 상태를 육안으로 분석한 결과 독성이 없음을 확인
4)STZ로 췌장을 손상시킨 ICR mouse에서 검정옥수수 polyphenol의 췌장베타세포 보호 활성 및 기전 분석
▪당화혈색소(HbA1c)측정,혈중 인슐린 농도 측정,췌장무게 측정,경구 내당능검사(OGTT)
▪8주간 섭취 후 STZ-당뇨군 및 STZ-양성대조군(glimepiride)에 비해 STZ-실험군(검정옥수수 추출물)에서 다소 통계적으로 유의하게 당화혈색소가 감소하였으며,내당능검사 (OGTT)에서 혈당강화효과가 우수하였으며,혈중인슐린 농도가 다른 군에 비해 다소 증가한 것으로 보였으나 통계적 유의성은 없었음
5)검정옥수수 폴리페놀의 당뇨치료 효능 분석 및 기능성 식품화를 위한 기초 안전성 평가
▪대조군(무처리군),양성대조군 (피니톨,자누비아)과 페루산 10% 추출물,국내산 검정옥수수 추출물 HP20의 8주처리 후 췌장,간,심장,신장,췌장의 무게에서 차이는 나타나지 않았으며,육안상의 색깔이나 외양의 차이를 볼 수 없었으며,ALT,AST,BUN의 차이가 없어서 간 및 신장 독성이 없다는 것을 보여주었음
▪국내산 검정옥수수 추출물 HP20은 혈액내 LDL-Cholesterol을 증가시켰으나 totalcholesterol은 크게 변화시키지 않았으며,오히려 TG(triacy glycerol)를 대조군과 같은 농도로 유지시켰음.양성대조군(피니톨, 자누비아)과 페루산 10% 추출물은 대조군 (untreated) 에 비해 LDL-cholesterol, HDL-cholesterol,totalcholesterol의 혈액 내 농도를 변화시키지 않았으나,TG의 농도는 상당히 감소 시켰음.
6)베타세포배양에서 검정옥수수 polyphenol의 혈당강하 및 세포보호 기전연구
▪췌장 islet을 anti-insulinantibody로 면역염색화학적 분석 결과 PCA(검정옥수수 10% polyphenol) 처리군에서는 약 80%이상의 세포가 insulin을 발현하는 세포로 확인되어 췌장베타세포 보호효과가 우수함을 보여주었음.
당뇨합병증으로 인한 활성손상과 사구체경화의 퇴치를 위한 검정옥수수 소재개발
1)고혈당에 의한 사구체경화에 대한 검정옥수수의 효능
▪33mM 포도당으로 처리된 mesangialcellconditionmedium에서 배양된 혈관내피세포는 VCAM-1, E-selectin,integrinβ1의 발현을 상당히 촉진함
▪VCAM-1,E-selectin,integrinβ1은 JAK family인 Tyk2에 의해 발현이 증가하는 것을 확인함
2)사구체 섬유증에 대한 검정옥수수의 invivo억제효능
▪고혈당으로 인한 신장 당뇨합병증에서 mesangium의 팽창으로 인한 신장 경화증에 검정옥수수 추출물은 억제 효과가 있는 것으로 확인함
▪검정옥수수 추출물은 IL-8-Tyk2-STAT으로 이어지는 염증성 singnaling을 억제하고,사구체에서 염증과 관련한 세포들의 침윤과 부착을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인함
3)사구체 경화와 신성 염증반응에 대한 검정옥수수의 invivo억제효능
▪검정옥수수 추출물은 사구체 내피세포에서 leukocyte recruitment와 adhesion을 억제하는 효과가 있는 것을 확인함
▪검정옥수수 추출물은 사구체에서 염증과 관련하여 대식세포들의 침윤과 신장 염증을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인함
임상시험 (단기 및 장기)
1)정상인에서 단기 경구내당능 (OralGlucoseToleranceTest,OGTT)분석
▪분석결과 A군 및 C군에 비해 B군에서 95%신뢰도로 통계적으로 유의성있게 glucose투여 후120분에서 혈당 강하 효과가 나타났으며,이는 검정옥수수 안토시아닌추출물이 정상인에서 처방약인 metformin보다 혈당강하효과가 있음을 보여줌
2)정상인에서 장기(8주간 투여 후)경구내당능 (OralGlucoseToleranceTest,OGTT)분석
▪8주간 섭취시킨 후 장기 경구내당능 (OralGlucoseToleranceTest,OGTT)분석결과 A군 및 C 군에 비해 B군에서 95%신뢰도로 통계적으로 유의성있게 glucose투여 후 120분에서 혈당 강하 효과가 나타났으며,이는 검정옥수수 안토시아닌추출물이 정상인에서 처방약인 metformin보다 혈당강하효과가 있음을 보여줌
3)정상인에서 장기(8주간 투여 후)당화혈색소혈중인슐린농도 및 혈당 분석
▪8주간 섭취시킨 후 혈중 당화혈색소(HbA1c),인슐린농도 및 혈당을 분석한 결과 당화혈색소 및 혈당은 정상인이어서 변화가 없었으나 혈중인슐린 농도는 검정옥수수 안토시아닌 추출물 투여군에서 다소 높았으나 개체 간 표준편차가 높아 통계적 유의성은 없었음
4)정상인에서 장기(8주간 투여 후)체중,허리둘레 및 혈압의 분석
▪8주간 섭취시킨 후 체중,허리둘레 및 혈압을 분석한 결과 통계적으로 유의성이 있는 차이를 나타내지 않았음
5) 정상인에서 장기(8주간 투여 후) 혈중 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, tryglyceride를 분석
▪8주간 섭취시킨 후 혈중 콜레스테롤,HDL-콜레스테롤,LDL-콜레스테롤,tryglyceride를 분석한 결과 통계적으로 유의성이 있는 차이를 나타내지 않았음
6)정상인에서 장기(8주간 투여 후)부작용 분석
▪8주간 섭취시킨 후 부작용을 분석한 결과 특별한 부작용을 보여주지 않았음
7) 정상인에 각군당 20명씩 A군(cellulose 300 mg) B군(검정옥수수 polyphenol 추출물 300mg)C군(Metformin300mg)을 단기 및 장기(8주간)투여하면서 여러 인자를 측정한 결과 B군(검정옥수수 polyphenol 추출물 300 mg)에서 단기 및 장기 내당능검사 (Oral Glucose ToleranceTest)의 혈당강하효과가 통계적으로 유의성있게 나타나서 검정옥수수 polyphenol추출물의 혈당강하 효능을 확인할 수 있었음

Abstract ▼

Ⅲ. Results
1. Optimization of Extraction Conditions of Anthocyanins from ZeamaysL. by Response Surface Methodology
Extraction characteristics of Purple corn (ZeamaysL.) and functional properties of corre sponding extract were monitored by response surface methodology(RSM). The experiment was c

Ⅲ. Results
1. Optimization of Extraction Conditions of Anthocyanins from ZeamaysL. by Response Surface Methodology
Extraction characteristics of Purple corn (ZeamaysL.) and functional properties of corre sponding extract were monitored by response surface methodology(RSM). The experiment was carried out in accordance with a central composite design(CCD) five-level and four-vari able approach. The optimum combination of solvent concentration (Ethanol and acid), extraction trmperature and time for the maximum extraction of phenolic compounds, Response of phenolic compounds such as total poly phenol content(TPC) and total anthocyanins content(TAC) were determined by the spectrophotometer assay.
The maximum extraction yield of 10.33% was obtained under the specific extraction condi tions, such as extraction temperature 58.87℃, extraction time 7.53 hr, solvent concentration 32.31%, and solvent volume 17.65(1:X). The maximum TPC was 7.89 mg/g at 29.29℃, 8.99 hr, 33.67%, and 10.25 (1:X). Also, The maximum TAC was 82.44 mg/L at 45.22℃, 7.85 hr, 34.14%, and 22.97 (1:X). Base on superimposition of three dimensional RSM with respect to extraction yield, TPC, and TAC obtained under the various extraction conditions, the optimum ranger of extraction conditions were found to be extraction temperature of 30-60℃. extraction time of 7.5-9.0 hr, solvent concentration of 32-34%, and solvent volume of 10-20 (1:X). At the random conditions (40℃, 8hr, 33% EtOH, 1:15 solvent volume) within the optimum extraction ranges, yield, TPC, and TAC were predicted as 5.76%, 4.58 mg/g, and 42,28 mg/L. respectively.
2. Aldose Reductase Inhibitory Activity of the compounds from the ZeamaysL.
7. phenolic compounds (compounds 1-7) and 8 anthocyanins (compounds 1-8) were isolated.
These compounds were investigated via rat lens aldose reductase (RLAR) inhibitory assays, hirsutrin showed most potent RLAR inhibitory potency with IC50 values of 4.78㎛. The refore, the Zea mays L. -derived hirsutrin may have a potential therapeutics against diabetic complication.
3. Protein tyrosine phosphatase 1β (PTP1β) inhibitory compounds from ZeamaysL.
To search for new types of PTP1β inhibitors, bioactivity-guided isolation and purification of the EtOAc and BuOH soluble fraction of ZeamaysL. Ethanol extract, using an invitroPTP1βinhibitory assay, In an attempt to identify bioactive components, five anthocyanins(cyanidin-3-glucoside, pelagonidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside, cyanidin-3-(6''malonylglucoside), peonidin-3-(6''malonylclucoside)), seven polyphenols (protochate chuic acid, vanillic acid, 2,4, 6-trihydroxy benzoic acid, 4-hydroxycinnamic acid, terulic acid, hirsutrin, 3'-methoxyhirsutrin) were isolated and the chemical structures there in were elucidated on the basis of spectroscopic evidence and comparison with published data.
These components were investigated PTP1β acitivity assasy, cyanidin-3(6''malonylglucoside), and 3'-methoxyhirsutrin showed most potent PTP1β inhibitory potency with 42.06 and 64.04 ㎛ respectively. As a result, this compound could be offered as a leading compound for further study as a new natural products drug for diabetes mellitus.
4. Purple corn anthocyanins dampened high-glucose-induced mesangial fibrosis and inflammation : possible renoprotective role in diabetic nephropathy
Purple corn has been classified as a functional food rich in anthocyanins possessing potential disease-preventive properties. This study examined whether purple corn anthocyanins (PCA) mainly comprised cyanidin 3-glucoside and cyanidin-3-(6″-malonylglucoside) can attenuate high-glucose (HG)-promoted mesangial cell (MC) proliferation and matrix accumulation, major features of diabetic glomerulosclerosis.
HumanrenalMCwereculturedfor3daysinmediacontaining5.5mMglucoseplus27.5mM mannitol as osmotic controls or media containing 33 mM glucose in the absence and presence of 1–20 μg/ml PCA. The HG exposure of MC caused substantial increases in connective tissue growth factor (CTGF) expression and collagen IV secretion with mesangial hyperplasia, which were repealed by adding PCA. PCA boosted HG-plummeted membrane type-1 matrix metalloproteinase expression and dampened HG-elevated tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 expression through disturbing transforming growth factor β (TGF-β)–SMAD signaling, facilitating extracellular matrix degradation. This study further revealed that PCA ameliorated HG-inflamed mesangial inflammation accompanying induction of intracellular cell adhesion molecule-1 and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) responsible for CTGF expression. The induction of intracellular cell adhesion molecule-1 and MCP-1 was mediated via TGF-β signaling, which was suppressed by PCA. In addition, the HG-promoted CTGF expression entailednuclearfactorκB(NF-κB)signalinginvolvedinMCP-1transcription.TheHG–TGF-β inductionwasblockedinthepresenceofaNF-κBinhibitor,andthenuclearNF-κB translocation was blunted by a TGF-β receptor 1 inhibitor. PCA dampened NF-κB translocation in HG-exposed MC. These results demonstrate that there was a crosstalk between TGF-β–SMAD and NF-κB pathways in the diabetes-associated mesangial fibrosis andinflammation,whichappearedtobeseveredbyPCA.
5.Purplecornanthocyaninsretarddiabetes-associatedglomerulosclerosisinmesangial cellsanddb/dbmice
Purpose Diabetic glomerulosclerosis is the hardening of the renal glomeruli that can leadtokidneyfailure.Intheearlystageofglomerulosclerosisoccurrenalmesangial expansion and renal filtration dysfunction. Purple corn has been classified as a functional food and is rich in anthocyanins exerting potential disease-preventive activities. The in vitro study using human renal mesangial cells examined that anthocyanin-rich purple corn butanol fraction (PCB) can attenuate high glucose(HG)-promotedmesangialcellproliferationandmatrixaccumulation.MethodsCellswere cultured for 3 days in media containing 33 mM glucose in the presence of 1–0 lg/mL PCB. In the in vivo animal study, db/db mice were treated with 10 mg/kg anthocyanin-rich polyphenolic extracts of purple corn (PCE) for 8 weeks.
Results HG enhanced mesangial production of the fibrosis biomarkers of collagen IV and connective tissue growth factor (CTGF), which was markedly attenuated by adding PCB.
Such mesangial fibrosis entailed interleukin-8 activation via eliciting Tyk2-STAT signaling pathway. PCB dampened HG-promoted mesangial hyperplasia that appeared to be attributed to increased expression of platelet-derived growth factor. The 8-week administration of PCE lowered plasma glucose level of db/db mice and ameliorated severe albuminuria. Moreover, PCE lessened collagen fiber accumulation in kidney glomeruli and CTGF expression via retarding TGF-b signaling. Protein expressions of nephrin and podocin, key proteins for filtration barrier function of the glomerular capillary wall, were repressed by treating mice with PCE. Conclusion Purple corn may be a potent therapeutic agent for the treatment for diabetes-associated glomerulosclerosis accompanying proteinuria and kidney filtration dysfunction.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 19
• CONTENTS ... 23
• 목차 ... 26
• 제 1장 연구개발과제의 개요 ... 29
• 제 1절 연구개발의 목적 ... 29
• 제 2절 연구개발의 필요성 ... 29
• 1.사회적인 필요성 ... 29
• 2.경제 ∙ 산업적 필요성 ... 30
• 3.기술적인 필요성 ... 31
• 제 3절 연구내용 및 범위 ... 32
• 1.연차별 연구개발의 목표 및 내용 ... 32
• 제 2장 국내외 기술개발 현황 ... 40
• 제 1절 국내 ∙ 외 기술개발현황 ... 40
• 제 2절 국내 ∙ 외 시장현황 ... 41
• 1.국내 시장 현황 ... 41
• 2.국외 시장 현황 ... 42
• 제 3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 43
• 제 1절 재료 및 연구방법 ... 43
• 1.재료 ... 43
• 2.HPLCPattern분석 및 총 폴리페놀함량 측정 ... 43
• 3.검정옥수수 구조 동정 ... 44
• 4.항당뇨 효과측정 ... 44
• 5.항당뇨합병증효과 측정 ... 44
• 6.반응표면분석법(ResponseSurfaceMethodology,RSM)을 이용한 최적의 추출조건 확립 ... 45
• 7.우수종 선별 ... 48
• 8. 검정옥수수 polyphenols의 항당뇨활성 및 췌장세포보호 효과를 2형 당뇨모델 동물인db/dbmouse에서 분석 ... 50
• 9.STZ-mouse에서 검정옥수수 폴리페놀의 당뇨치료 효능 분석 ... 50
• 10.안전성 평가 (db/db-mouse에서 검정옥수수 폴리페놀의 당뇨치료 효능 분석 및 기능성 식품화를 위한 기초 안전성 분석) ... 51
• 11.베타세포배양에서 검정옥수수 polyphenol의 혈당강하 및 세포보호 기전연구 ... 51
• 12.고혈당에 의한 사구체 경화에 대한 검정옥수수 추출물의 억제능 ... 51
• 13.고혈당에 의해 유도된 사구체 섬유증에 대한 검정옥수수의 억제효능 ... 52
• 14.사구체 경화와 당뇨병성 신장병증의 염증반응에 대한 검정옥수수의 억제효능 ... 53
• 15.임상시험 (혈당조절용 건강기능식품소재로의 개발을 검정옥수수 폴리페놀의 정상인에서 혈당조절 임상시험) ... 54
• 16.안정성 평가 ... 55
• 17.기준규격 설정 ... 56
• 18.시제품 제작 ... 56
• 제 2절 연구결과 ... 57
• 1.HPLCPattern분석 및 총 Polyphenol함량 측정 ... 57
• 2.검정옥수수 구조 동정 ... 58
• 3.항당뇨효과 측정 ... 66
• 4.항당뇨합병증효과 측정 ... 68
• 5.반응표면분석법(ResponseSurfaceMethodology,RSM)을 이용한 최적의 추출조건 확립 ... 72
• 6.우수종 선별 ... 78
• 7.검정옥수수 polyphenols의 항당뇨활성 및 췌장세포보호 효과를 2형 당뇨모델 동물인 db/dbmouse에서 분석 ... 96
• 8.STZ-mouse에서 검정옥수수 폴리페놀의 당뇨치료 효능 분석 ... 100
• 9.안전성 평가 (db/db-mouse에서 검정옥수수 폴리페놀의 당뇨치료 효능 분석 및 기능성 식품화를 위한 기초 안전성 분석) ... 103
• 10.베타세포배양에서 검정옥수수 polyphenol의 혈당강하 및 세포보호 기전연구 ... 111
• 11.고혈당에 의한 사구체 경화에 대한 검정옥수수 추출물의 억제능 ... 114
• 12.고혈당에 의해 유도된 사구체 경화에 대한 검정옥수수 추출물의 억제능 ... 126
• 13.사구체 경화와 당뇨병성 신장병증의 염증반응에 대한 검정옥수수의 억제효능 ... 130
• 14.임상시험 (혈당조절용 건강기능식품소재로의 개발을 검정옥수수 폴리페놀의 정상인에서 혈당조절 임상시험) ... 141
• 15.안정성 평가 ... 147
• 16.기준규격 설정 ... 148
• 17.시제품 제작 ... 148
• 제 4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 151
• 제 1절 연구개발 목표의 달성도 ... 151
• 1.1차년도 연구개발목표에 대한 달성도 ... 151
• 2.2차년도 연구개발목표에 대한 달성도 ... 153
• 3.3차년도 연구개발목표에 대한 달성도 ... 154
• 제 2절 관련분야의 기술발전에의 기여도 ... 158
• 1.활용방안 ... 158
• 2.기대효과 ... 158
• 제 5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 160
• 제 1절 연구개발 성과 ... 160
• 제 2절 성과 활용계획 ... 170
• 제 6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 172
• 제 7장 참고문헌 ... 174
• 끝페이지 ... 179