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Kafe 바로가기주관연구기관 | 매일유업(주) Maeil R&D Center |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2012-06 |
과제시작연도 | 2011 |
주관부처 | 농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
과제관리전문기관 | 농림수산식품기술기획평가원 Korea Institute of Planning and Evalution for Technology of Food, Agriculture, Forestry and Fisherie |
등록번호 | TRKO201400026583 |
과제고유번호 | 1545002518 |
사업명 | 고부가가치식품기술개발 |
DB 구축일자 | 2014-11-10 |
DOI | https://doi.org/10.23000/TRKO201400026583 |
Ⅲ. 연구결과
1. 제빵용 한국토종효모자원 개발 및 제과ㆍ제빵적용(선행연구결과)
한국토종효모 발굴 및 이의 산업화 관련 선행연구(과제번호 : 109115-02, 농기평) 결과에서 확보된 KNOW-HOW를 연계하여 전체연구를 진행하였는데, 선행연구를 통한 확보기술은 다음과 같이 요약할 수 있다.
유기농업현장(과일 및 과실)내 제빵용 한국토종효모 선발 및 유전자 확보를 완료하였다[특허출원번호(10-2009-0134773) : 신규효모 및 그를 이용한 빵의 제조방법(2009년), 확보균주(특허): Saccharomyces
Ⅲ. 연구결과
1. 제빵용 한국토종효모자원 개발 및 제과ㆍ제빵적용(선행연구결과)
한국토종효모 발굴 및 이의 산업화 관련 선행연구(과제번호 : 109115-02, 농기평) 결과에서 확보된 KNOW-HOW를 연계하여 전체연구를 진행하였는데, 선행연구를 통한 확보기술은 다음과 같이 요약할 수 있다.
유기농업현장(과일 및 과실)내 제빵용 한국토종효모 선발 및 유전자 확보를 완료하였다[특허출원번호(10-2009-0134773) : 신규효모 및 그를 이용한 빵의 제조방법(2009년), 확보균주(특허): Saccharomyces cerevisiae JKK091002(특허수탁번호 : KCCM 11056P)]. 선발효모의 대량생산형 배지조성 및 배양조건 정립(동결분말형 효모 기준 : 생산수율 5%) 및 대량생산 시스템(압착효모 : 7,000톤/년, 동결분말형 효모 기준 : 생산효율 5%) 정립 및 산업화 관련 ROADMAP을 완료 하였다. 그리고, 개발 천연효모적용 특화 제빵 제조기법(레시피) 정립 및 이의 사업화 시점에 있다.
2. 한국토종효모자원 추가 선발 및 유전자원 확보
선행연구결과와 연계하여 한국토종효모자원 추가선발 및 유전자원 확보를 위하여, 62장소의 유기농 현장에서 140종의 유기농 시료(과일류, 과채류, 채소류, 버섯류 등)를 채취한 후 효모류 및 유산균류를 분리 및 동정하였다. 결과로서, 유산균류는 효모류 중 4종의 S.cereviase, 13종 Candida spp 및 유산균류는 14종(Lactococcus spp, Leuconostoc spp, Lactobacillus spp류)이 분리 동정되었다.
한국토착형 효모선발을 위하여, 5% sucrose 배지내 과일표피를 분취 및 분쇄하여 접종하고 3일동안 배양(30℃, 습도:50%)을 실시함으로서, 효모 분리를 위한 배지 및 배양조건으로 하였다. 효모 분리를 위하여, 일정별 분취배양액을 TSA(총균수 확인), PDA(효모선발) 및 BCP(유산균) 고체영양배지에 배양후 Colony의 형태를 육안 및 현미경으로 검경을 통하여 효모분리균 1차 분리한후 이를 계대순수분리(3세대, PDA) 하여 동정하였다. 순수분리 후 효모균의 동정은, 1단계(API Kit, Model :C-AUX), 2 단계 Vitek 분석시스템(BioMeriex VITEK사, 프랑스) 및 Kit(Model : YST), 그리고 3단계는 Diversilab시스템(BioMeriex VITEK사, 프랑스) 및 Kit(Model : Saccharomyces Kit)를 사용하여 동정을 완료하였다.
분리 및 동정이 완료된 효모는 (주)마크로젠사(한국)에 의뢰하여 Gene cloning 동정을 실시하였으며, Chromatogram과 Sequencing 결과비교(Blast, NCBI)를 통하여 99%이상의 유전자 상동성을 확인하였다.
결과로서, 62장소의 유기농 현장에서 140종의 유기농 시료(과일류, 과채류, 채소류, 버섯류 등)를 채취한 후 효모류 및 유산균류를 분리 동정 결과, 유산균류는 효모류중 4종의 S.cereviase, 13종 Candida spp 및 유산균류는 14종(Lactococcus spp, Leuconostoc spp, Lactobacillus spp류)이 분리 동정되었다. 이중 4종 효모에 대하여 S.cereviase JKK091006 S.cereviase JKK091002, S.cereviase CKK110426 그리고 S.cereviase OKK110427로 명명하였다.
3. 선발 한국토종효모에 대한 대량생산시스템 정립(선행연구)
천연 유래 선발효모(Wild Type)의 경제적 생산을 위한 필수조건인 대량생산용 배지선발 및 배양조건 정립과 투입되는 원료대비 고효율의 효모 생산성(생장성 향상) 및 수익성을 극대화 할 수 있는 생산시스템 확립을 완료하였다. 필수정립항목으로서, 염 및 알코올 내성균주의 선발, 선발배지 원료의 전처리 공정설계, 고농도 배양방법 설계, 배양법 최적화(농도 fed-batch배양, 발효종료시 후처리 방법 정립), 압착효모 생산방법 정립 및 규모별 생산시스템 구축계획으로 구분 일관되게 정립하였다.
제빵효모 생산 발효기술 및 제품화 기술개발결과는 다음과 같다.
가. 염 내성 및 알코올 내성 균주의 선발
NaCl 1~10%가 포함된 PDB broth에 미리 배양한 종배양액(Saccharomyces cerevisiae JKK091006)을 넣어 1~2일간 30℃, 200 rpm에서 배양하여 한계 생장점을 확인하고, 이로부터 단계별로 염 농도를 높여가며 염 내성을 부여하였으며, 동시에 알코올 내성을 부여하였다. 선발된 균주는 당밀 전처리, 배지 최적화 및 발효 공정 설계를 위해 최종 glycerol 15% 용액이 되도록 -70℃에서 동결 보존하였다.
나. 배지 원료의 전처리 공정 설계
당밀 (필리핀, 해바라기 유기농)을 적당히 희석하여 암모니아(Junsei chemical Co., Ltd., minimum 28%), 인산(85%), 기타 미네럴을 첨가하여 발효조에서 효모의 생장 패턴을 분석하였으며, 생장 속도 및 생장율이 가장 좋은 패턴의 조건를 설정하였다. 또한 당밀 내의 미네럴 성분을 ICP분석기를 이용하여 제빵효모가 필요한 영양성분이 함유될 수 있도록 추가적인 미네럴을 첨가하였다.
다. 고농도 배양 방법 설계 및 최적화
당밀의 전처리 최적화와 함께 천연 유래 효모의 최적화 생산을 위해 intermittent feeding strategy, constant feeding strategy을 이용한 fed-batch 최적화, 기타 효모 생장에 따라 feeding 속도를 증대하는 방법 등을 통하여 효모의 생장성과 생균수 증대를 높이기 위해 가장 적합한 생산 방법을 개발하였다.
라. 고수율 압착효모 생산 및 제품화(제형화) 정립
산업적인 생산에서 일반적으로 사용하는 압착효모 생산 방법과 이로부터 발생할 수 있는 장단점에 대하여 고찰하며, 실험실 수준에서 수행 할 수 있는 방법으로 시제품 생산 및 시제품을 제빵 적용특성을 확인하였다.
고농도 효모 배양결과로서, 배양액당 2.5×109CFU/ml이상 그리고 압착효모(수분 70~74% 함유)는 1.15×1010CFU/g의 고농도 균수를 나타내었다.
생산수율 검정결과, 동결건조형은 5.4%(w/w), 압착효모는 18%(수분함율량 : 70~74%, w/w)의 높은 생산효율을 보였다.
생산효모의 제품화(제형화) 검토결과, 건조형(수분: 5%, w/w)과 압착형(수분함유량 : 70~74%, w/w)으로 구분하여 정립 완료하였다.
마. 수익성 확보형 생산시스템 구축
생산규모는 1,800톤/년(건조형 효모기준), 생산규모(3단계)는 5톤, 50톤 및 500톤으로 구분하여 경제성 평가를 완료하였다.
4. 제과용 선발효모 및 기능성 소재 대량생산시스템 정립(4단계)
본 연구는 선행연구결과를 적용하여 효모균 및 유산균류 배양시설과 관련 전문지식을 보유하고 있는 아미코젠(주)에 위탁하여 선발효모 및 기능성 소재 대량생산시스템 정립과 더불어 시제품 및 시작품을 4단계를 구분하여 제조하였다.
가. 선발효모(Wild-Type) 생산수율 증대형 배지 및 배양조건 정립(1단계)
선발효모 4종류와 표준효모(선행연구)를 대상으로 선행 정립된 배양배지조건(당밀 배지)에서 발효(5L jar fermenter)를 수행함으로써, 목표 생산수율(동결건조분말효모 기준 : 5%)을 나타내는 최적의 효모선발과 배지 및 배양조건을 확인하고 져 하였다.
결과는 다음과 같다.
발효액 대비 개발효모별 압착효모(수분 70% 기준) 생산수율과 효모균수를 조사하여 보았더니, S.cereviase JKK091002는 20.8%, S.cereviase OKK110422 19.4%, S.cereviase CKK111111는 16.8% 그리고 C.utilis의 경우는 35%로 가장 높은 생산수율을 보였다. 이때 효모균수를 비교하여 보았더니, 대조 상업효모의 경우는 1.8x1010 cfu/g, 개발효모인 S.cereviase JKK091002는 3.4x1011cfu/g, S.cereviase OKK110422는 1.7 x1012cfu/g, S.cereviase CKK111111는 6.8x1012cfu/g 그리고 C.utilis의 경우는 8.9x1013cfu/g의 균수를 보유하고 있었다.
발효액 기준으로 선발효모별 동결건조후 생산효율을 비교하여 보았다. 전체시험구에서 4%~5% 범위의 생산수율(동결효모분말 기준)을 보였으며, 정립된 배지 및 배양조건에서 동일한 적합성을 나타내었다(P<0.05).
나. 최종선발 효모의 대량생산시스템 정립(2단계)
1단계 검정결과를 토대로, 5% 이상의 생산수율을 보였던 C.utilis와 제빵적용성 평가에서 가장 우수한 발효력을 보였던 S.cereviase CKK110426를 선발하고, 대량생산시스템 적용전에 중형 pilot scale(50L fermentaer)에서 상업적 생산성을 검정하였다. 결과로서, 동일배지 및 배양조건에서 5%이상(동결건조 기준)이 생산성을 나타내어 선발 효모류에 대한 대량생산이 가능함을 확인하였다.
다. 선발효모내 기능성소재 분리기법 예비 정립(3단계)
1~2단계에서 검정한 결과를 토대로 실제 10톤 규모의 대형 발효생산시스템 적용하여 생산한 효모를 대상으로, 세포파쇄기를 이용하여 파쇄한 효모와 비파쇄한 효모를 autolysis(단백 분해효소 투입)하여 최대 수율을 나타내는 효모추출물 및 세포벽 분획물 생산성을 확인하였다. 결과로서, 비파쇄 효모를 적용 시 효모추출물 및 세포벽 분획물의 생산효율이 더 좋은 것으로 확인 되었다.
라. 선발효모내 기능성 소재(세포벽 및 추출물) 대량생산시스템 정립(4단계) 1~3단계를 결과를 토대로, 효모추출물 분말 및 세포벽 분획물에 대한 대량생산시스템을 정립하였다.
5. 개발효모 제품화 특성조사
가. 개발효모 TYPE(압착형 및 분말형 구분)별 장단기 보관성 평가
개발효모에 대한 개발효모제형별(압착형 및 동결분말형)로 구분하여 장단기(0일, 30 일, 1년) 및 보관온도별(상온 및 냉장)보관성 평가결과는 다음과 같다.
유효보관기간 평가결과, 냉장조건하에서 압착효모형은 1개월, 분말형은 1년이내였다. 이는 상업효모 대비 동등성을 보유하고 있었다(P<0,05). 또한, 시간이 경과시, 효모 균수 변화를 확인하여 보았더니, 1개월 이상 장기보관시, 제형 및 보관온도에 상관없이 최대 20%까지 효모균수는 감소하는 결과를 보였다(P<0.01).
성상변화는, 시간이 경과 시 곰팡이, 갈변화 및 이취가 심하게 발생하였다(P<0.01, 건조 효모 제외).
나. 개발효모별 기능성 물질 함유량 조사
아미노산 조성은 상업효모 대비 5종 개발효모류(S.cereviase JKK091002, S.cereviase CKK110426, S.cereviase OKK110427 그리고 C.utilis)의 아미노산 구성(필수아미노산 18항목기준)을 비교하였다. 결과로서 총아미노산의 함유량을 상업 효모(14.1%) 대비 비교한 결과, 개발효모류중 S.cereviase의 경우는 약 11%, C.utilis는 7.68%로 차이를 나타내었다(P<0.05)
기초영양성분조사(총단백질, 조지방, 탄수화물, 회분 및 미네럴 함유량 등)는 상업효모 대비 총단백질 , 조지방, 탄수화물 및 회분의 수치차이는 인정되지 않았지만 미네럴(8항목 : Ca, P, Mg, Fe, Zn, S, Se, Mn) 분석을 실시한 결과, C.utilis(1기준)가 S.cereviase보다 전체적으로 미네럴의 함유량이 높게 나타났다(칼슘:26배, P: 3.3배, Mg : 3.2배, Fe:6.4배, Zn : 4.2배, S : 1.3배, Se:불검출, Mn:불검출). S.cereviase 시료내 비교에서 상업효모 대비 전반적으로 개발효모의 미네럴 수치가 높게 나타났는데, 야생에서 분리 효모균의 특성으로 생각되었다(P<0.05). 즉, 칼슘기준으로 상업효모(칼슘함유량 : 47ppm), S.cereviase JKK091002는 170ppm S.cereviase CKK110426은 497ppm 그리고 S.cereviaseOKK110427의 경우는 812ppm 으로 함유량 차이가 인정되었는데, 전체 미네럴에서 유사한 패턴을 보였다.
6. 대량생산 기능성 소재별 특성 및 제품적용성 사전평가
가. 핵산함유량 비교조사
선발효모에서 추출한 효모추출액을 RNAase처리시 효모추출물이외 기능성 소재인 핵산류는 4종(GMP, CMP, AMP, UMP)이 대표적으로 함유 되어 있었는데, 전체는 20%~25% 범위 그리고 핵산별로는 약 5%범위의 함유량을 나타내었다.
나. 효모추출물 분자량 범위 조사
선발효모(S.cereviase CKK110426)에서 대량생산한 기능성 소재중 수용성인 효모추출물을 상용효모추출물(대조)과 분자량(FPLC analysis System)을 비교함으로서 순도 및 특성을 평가하였다. 결과로서, 대조 대비 90%이상 동일 분자량 범위를 보유한 물성을 보유하고 있었으며, 수용성 성분임. 10%이내의 분자량 차이를 보이는 이유는 추출 효모종의 차이로 인한 것과 추출방법의 차이로 인한 것으로 판단되었다.
다. 기초영양성분조사(총단백질, 조지방, 탄수화물, 회분 등)
S.cereviaseOKK110427 대비 기능성 소재류(β-Glucan, 효모추출물)의 총단백질, 조지방, 탄수화물 및 회분의 수치차이는 인정되지 않았다. 그러나, 미네럴류(12항목 : Ca, Fe, Zn, Cu, Se, P, Mn, Mg, Pb, Cd, As, Cr)를 비교 분석하였다. 칼슘함유량을 기준으로 효모에서 분리한 세포벽(β-Glucan)의 전체 미네럴 함유량은 미미한 것으로 나타났으나 전체 효모추출물내 미네럴 수치는
S.cereviaseOKK110427(1,136ppm, 1 기준) 대비 1.08~1.27배로 유사하게 나타났
다. 그러나 기타 미네럴의 함유량은 전체적으로 감소하였다(P<0.01)
라. 열안전성 평가(액상 및 분말형 구분)
1) 효모추출물
유기농 현장선발 효모(S.cereviase CKK 110426) 대비 분리 기능성 소재(세포벽: β-Glucan, 핵산 함유 추출물)별,액상(2%, w/w)과 분말형으로 구분한 후 열안정성 검정 결과를 토대로 최종 제과∙제빵용 적용시 안전(정)성을 미리 예측코 져 하였다. 결과로서, 분말형의 경우는 β-Glucan이외 효모추출물의 경우는 90℃이상 고온처리시 성상 변화 (갈변화)가 유발되었으며, 온도처리에 비례하였다. 그러나, 액상형의 경우는 성상변화(갈변화) 및 분자량 변화는 없었다. 따라서, 적용성에 있어 고상형보다는 액상형 처리가 효과적이라고 판단되었다.
2) 핵산류
선발효모에서 추출한 효모추출액을 RNAase처리시 효모추출물 이외 기능성 소재인 핵산류는 4종(GMP, CMP, AMP, UMP)이 대표적으로 함유 되어 있었다. 따라서, 기능성 소재인 핵산류를 제과∙제빵적용성 및 용도용법 확대를 위하여, 고상형 및 액상(2%, w/w)상태에서 열안정성 검정을 실시하였다. 결과로서, 고상 및 액상형 공히 70℃이상의 고열에서 핵산류 고유분자구조가 파괴되면서 성상(갈변화)변화가 나타났는데, 온도에 비례하여 증가하였다.
3) 효모추출 핵산류(복합핵산류) 장단기 보관 안전성 평가(32일, 상온보관, 액상) 선발효모 및 상용효모 추출물내 핵산류는 크게 4종(CMP, UMP, GMP, AMP)이 함유되어 있었다. 따라서, 표준체를 기준으로 상기 5종의 핵산류 Mixer 용액을 장기보관(32일, 상온, 핵산류별 1% 혼합용액 조성)시, 안정성 평가(FPLC)를 토대로 제품적용시 효능의 안전(정)성을 미리 예측코 져 하였다. 결과로서, 액상조건에서서 장기보관에 따라 저분자화 되는 방향으로 분자량 변화가 관찰됨으로서, 분말상 보관을 원칙으로 하고, 액상 적용시는 단시간에 사용하여야 할 것으로 판단되었다.
4) 효모분리 단일 및 복합핵산류에 대한 미네럴 간섭효과(킬레이팅) 평가
선발효모 및 상용효모의 추출물내 핵산류는 크게 4종(CMP, UMP, GMP, AMP)이 함유되어 있었는데, 이들 핵산류의 화학구조는 리보오스 1분자와 특정 아미노산 및 P을 보유하고 있는 공통구조를 보유하고 있다. 이중 P의 경우는 미네럴류와의 킬레이팅 능력을 보유하고 있을 것으로 예측되어, 칼슘(CaCl2)만을 대상으로 IMP를 추가한 5종 복합핵산류 조성액(2%, w/w)과 단일 핵산조성액(2%, w/w)으로 구분하여 각각 조성하고 이를 비열처리 및 열처리조건에서 각각 비교 검정하였다. 결과는 다음과 같다.
5) 혼합 핵산류
칼슘 킬레이팅 반응종료 후 생산수율(불용화 침전물 동결건조)은 5% 이내로 매우 낮았으며, 열처리후 상등액내 핵산류와 칼슘 혹은 이온반응으로 인하여 겔화반응이 유발되었다.
6) 복합핵산류의 결과를 확인하기 위한 차원에서 단일 핵산류만를 대상으로 각각 검정(불용성화 핵산류에 대한 ICP분석 결과)한 결과에서 AMP (81.5%) > GMP(74%) > IMP(70%) > 혼합(3.6%) > CMP(1.2%)순으로 칼슘에 대한 킬레이팅 능력 차이를 보였다. 추후, 핵산류의 각각에 대한 미네럴별 킬레이팅 반응성을 세세하게 검정할 필요가 있다고 판단되었다.
7. 개발 기능성소재의 사전 안전성(Cell-line) 평가
선발효모 유래 기능성 소재별, 농도별로 광역 안전성 스펙트럼을 사전확인하기 위한 표준체로서 Sialic acid는 매일유업(주) 중앙연구소에서 기증 받아 사용(순도 : 98%)하여 안전성 평가기법 사전정립을 완료하였다. 이에, 선발효모 유래 기능성 소재로서 효모추출물 및 효모추출물내 함유된 5종 핵산류를 주유대상으로 하여 RAW264.7(macrophage cell) cell를 이용하여 MTT, NO 검정을 거쳐 최적농도범위를 선정하기 위한 사전안전성을 평가하였다.
이를 위하여, 효모추출물내 함유량과 동일한 핵산류(5종 : GMP, UMP, CMP, AMP, IMP)에 대하여, 단일(AMP, IMP) 및 복합핵산류(GMP+UMP+CMP)처리구로 조성하고, 이를 농도별 처리(무처리, 0.5%~1.0%, w/w)로 처리시 항염증지표(NO) 및 독성지표(MTT)조사 결과를 연계하여 기초효능평가를 예측코 져 하였다. 결과는 다음과 같다.
가. 핵산류중 IMP는 0.5% 이상처리시 세포의 생장 촉진(MTT)과 더불어 항염증 효과(NO)가 동시에 인정되었으며, APM은 0.5% 이상의 농도에서 항염증 효과 보다는 세포생장에 유의한 효과가 있는 것으로 평가되었다(P<0.01).
나. 기능성소재류의 표준세포주에 대하여 독성유발(MTT) 관련 농도범위가 0.5%~2% 이고 항염증(NO)효능을 보이는 농도는 0.5%~10% 범위를 보였다.
1) 세포독성(MTT) 유발 소재와 농도는 UMP와 CMP는 0.5%로 가장 높았으며, 다음으로는 효모추출물, AMP와 IMP처리구의 경우이며, 공통적으로 0.75% 다. 5종혼합핵산류 처리구는 1%이고 GMP 처리구는 2% 이상의 농도를 첨가시 독성이 있는 것으로 평가되었다(P<0.05)
2) 항염증(NO)효능은 효모추출물의 경우 0.5%, 5종 핵산혼합처리구와 GMP처리구는 2% 그리고 CMP처리구의 경우는 10% 이상의 농도처리시 유의성이 인정되었으며, 기타 소재에서는 인정되지 않았다(P<0.05).
다. 종합적으로, 효모추출물의 경우가 가장 우수한 소재로 평가 되었으며 첨가농도는 0.5%~1%범위 였고, 5종혼합핵산처리구로서 1~2%, GMP는 2%이상 그리고 CMP의 경우는 10%이상의 농도일 때 안전성이 확보 되면서 항염증 저하등의 복합 기능성을 나타내는 것으로 최종 평가 되었다.
상기 결과를 토대로, 동물임상시험과 제과∙제빵 적용성 평가시 목표로 하는 효능(안전성)을 검정하기 위한 최적 농도로서 0.5%~1%를 설정하였다.
8. 동물임상 평가(안전성 및 기초효능 평가)
가. MIC설정근거 동물임상용 사료제조
1)기능성소재 동물임상평가를 통한 안전성 평가를 위한 전체적인 구성은 사료 레시피는 AIN-76A를 기본식이로 하는 대조구, 비교구 2군(5종 핵산혼합, Yeast NT) 및 실험구 2군(β-Glucan, Aromild)으로 하였고, 각 농도는 1%(L;low), 5%(M;Medium) 및 10%(H;High)로 혼합 조성하였다(β-Glucan는 0.1%,0.5% 및 1% 조성).
2)전체시험구의 사료 레시피는 AIN-76A를 기본식이로 하여 비교구 2군(5종 핵산혼합, Yeast NT) 및 실험구 2군(β-Glucan, Aromild)으로 하였고, 각 농도는 1%(L;low), 5%(M;Medium) 및 10%(H;High)로 혼합 조성하였다(β-Glucan는 0.1%,0.5% 및 1% 조성). 비교구는 C. utilis 분리 추출물인 Aromild(상품명, 일본 KOHJIN사)의 핵산 함량을 분석(CMP 7.1%, UMP 8.9%, GMP 5.3%, IMP 3%, AMP 0.7%)하여 핵산을 기본식이에 첨가하였으며, C. utilis 분리 추출물인 Yeast NT(상품명, KOHJIN, 일본)를 기본식이에 조성 조정하였다. 실험구는 S. cereviase 에서 분리한 세포벽 ß-Glucan (오리엔탈사, 일본)과 C. utilis 분리 추출물인 Aromild (상품명, 일본 KOHJIN사)를 기본식이에 조성 조정하였다.
나. 장단기 섭이를 통한 동물 안전성 평가(총 8주)
시험동물에 조성 사료를 자유섭이토록 한 후 4주, 8주에 각각 생장관련 및 도살조건하에서 안전성평가 항목별로 조사하였다. 주요 평가항목으로 사료효율(성장), 무게(총무게 및 기관별), 기관별 조직병리, 혈액지표 및 염색체이상 조사 및 장내미생물총 변화로 하여 총 8개 항목으로 대별하였다.
1) 일정별 성장률 및 섭취율 조사
일정별로 구분하여 사료섭취량과 관련한 일일성장률(24시간 단위로 8주 동안 측정)을 대조구(AIN-76A섭취 마우스) 대비 비교구 2군(5종 핵산혼합, Yeast NT) 및 실험구 2군(β-Glucan, Aromild)와 비교하여 보았더니, 차이가 인정되지 않았다 (P<0.05).
2) 총무게 및 기관별 무게 변화
생체중 및 기관별 무게변화에 미치는 결과를 역시 기간별로 구분하여 대조 대비 비교구 2군(5종 핵산혼합, Yeast NT) 및 실험구 2군(β-Glucan, Aromild) 비교하여 보았다.
결과로서 생체중 및 근조직(5개기관 : Liver, Kidney, Spleen)과 골조직(1개 : femur) 전체시험구에서 기간별 농도별 상관없이 비장의 크기가 대조구(체중 1기준, 0.009) 대비 비교구 및 실험구(0.003~0.006) 차이가 인정되었으며, 간, 신장 및 대퇴골의 무게 차이는 인정되지 않았다(P<0.05).
3) 혈액이상 및 이화학적 지표 조사
기능성소재의 생장관련 안전성 결과를 기초로, 추가적으로 혈액조성과 지표안전성 및 염색체 이상 조사를 통하여 생체내 안전성 결과를 조사하여 보았더니, 혈액학적 지표를 통해 4주차에서는 백혈구 및 림프구의 저하로 감염위험이 있는 것으로 판단되었으나, 8주차에 재측정 결과 마우스의 면역 항상성 유지에 이상이 없는 것을 확인하였으며, 혈액생리학적 지표를 통해 YeastNT와 핵산에서 간세포가 손상되었으나 재생회복되는 정도의 독성을 나타내었다. 그 외 다른 중요장기 및 질병에도 이상이 없음을 확인하였다. 또한 MN분석을 통해 기능성소재를 섭취한 마우스의 염색체에 이상이 없음을 재차 확인하였다(P<0.05).
4) 장내 미생물총 변화 평가
개발 기능성소재를 농도별 및 섭이기간(4주, 8주 및 13주)에 따라 장내미생물총 변화를 유발하는지를 총균수(TSA배지) 대비 대장균구(MacConkey배지) 및 유산균 (BCP 배지)으로 구분하여 호기조건하에서 확인하였다.
결과로서, 마우스가 성장함에 따라 대조구 및 비교구와 실험구의 장내 미생물의 분포를 볼 때 대장균 및 유산균의 수가 증가하지만 기능성소재의 지속적인 섭취시 대조군 대비 마우스 장내의 미생물 분포의 증가 양상이 대장균에 비해 유산균의 증가 폭이 큰 경향이 있지만, 통계적으로 유의한 수준은 아니다.
따라서, 기능성 소재별 및 농도별 안전성 및 기초효능 평가를 기준으로 동물 전임상을 통한 미생물 분포 분석결과 제빵/제과 제품 적용시 1%이상의 농도에서도 기능성소재의 섭취는 대조구와 큰 차이가 없음을 확인하였다.
5) 핵산섭취마우스의 성적난폭성 이상조사.
동물전임상 평가중 핵산류 섭이후 2일이 경과시, 성적 난폭성이 나타남에 따라, 표준주의 결과와는 다른 차이를 보일 수 있을 것으로 예측할 수 있었다. 따라서, 핵산류의 농도별 섭이에 따른 긍정적 혹은 부정적 생체반응결과를 확인하므로서, 이 결과를 기초로 제빵/제과 제품적용성 평가와 관련 제품화 연구방향을 설정코 져 하였다.
가) 기본사료만을 섭이시킨 대조구와 처리구(Low, medium, high dosage)의 고환을 적출하여 조직학적 검증을 실시하였더니, 대조구의 경우에서는 곱슬정세관에서 정자 형성과정과 관계되는 정원세포부터 정자세포까지 모두 관찰되었으나, 실험구의 정세관에서 정자형성과정은 정자방출과정이 우세함으로서 정세관의 내강이 비어있는 것처럼 관찰되었다.
나) 이러한 결과는 핵산섭이에 따라 정상적인 생식활동보다는 정자방출이 우선함으로서 생식행동의 변화를 초래했을 것으로 판단된다. 이러한 결과를 정밀하게 확인하기 위하여는 추가적으로 시간적인 부분과 관련 호르몬 조사를 병행하면서 성적 관련 호르몬 변화 패턴을 세세하게 조사할 필요성이 대두 되었다.
9. 개발효모 및 기능성 소재 제과ㆍ제빵 적용성 평가 결과
개발 기능성 소재별 사전안전성 및 기능성(항염증 증대효과, 세포독성 및 성장 관련 평가) 결과를 토대로 기능성 소재(4종 Mix 핵산류, 제과∙제빵 적용성 평가를 실시하였는데, 상용 제조레시피가 알려진 제과분야 24항목 그리고 제빵분야 24항목에 대한 예비 적용성 평가를 실시한 후 ‘프랑스빵’을 최적시료로 선발하여 이를 기준으로 제과∙제빵 적용성을 평가하였다. 제과∙제빵 제조 레시피 설정은 단일 개발효모적용 및 단일 기능성 소재 첨가조건과 동시 첨가에 따른 최종 제과∙제빵제조 레시피 및 이를적용에 따른 결과는 다음과 같다(기준 : 프랑스빵).
가. 개발효모 적용 일반 레시피 절차는 재료정량[강력분 1,000g+물 600g+개발 압착효모 50g+소금 : 18g]->반죽제조(최종 전단계)-> 1차 발효(30℃, 수분: 80%, 30분)->분할( 270g)-> 중간발효(30분, 상온)->정형(로드형 및 원형) 및 패닝-> 2차발효(30℃, 수분: 80%, 40분)-> 굽기 : 200℃/180℃(25℃) 순으로 진행하였다.
개발효모 및 기능성 소재 동시 적용레시피 절차는 재료정량[강력분 1,000g+ 물 600g, 압착효모 50g(분말형 효모 25g)+소금 18g+각 소재별 50g(5%, w/w)]-> 반죽제조(최종 전단계)-> 1차 발효(30℃, 수분: 80%, 30분)->분할(270g)->중간발효(30분, 상온) -> 정형 및 패닝-> 2차발효(30℃, 수분: 80%, 40분)->굽기 : 200℃/180℃(25℃)순으로 진행하였다.
결과로서, 4종 시제품 개발효모에 대한 제빵적용성 평가(식빵 기준)에서, 상용효모대비 C. utilis외 3종 S.cereviase류는 제빵 적용성(발효율 및 상품성)에 있어 적합한 것으로 평가되었다(P<0.01).
나. 개발효모 및 기능성 소재 첨가에 따른 발효특성비교(발효단계별 발효율 비교)
개발효모는 개발효모에 대한 제과/제빵 적용성 평가결과, 제과∙제빵 제조용 및 기능성 소재 제조용으로 동시적용이 가능한 효모는 3종효모(S.cereviase JKK091002, S.cereviase CKK110426, S.cereviase OKK110427)였으며 그리고 C.utilis는 기능성 소재 제조용으로 적합하였다(P<0.01). 제과 및 제빵적용성 평가를 거쳐 최종 선정된 4종의 효모류에 대하여 특허(유전자) 확보 절차가 진행 중이다.
기능성 소재는 효모 세포벽 분리시료 첨가시, 제빵발효율은 대조 대비 80%수준이였다. 효모 추출물 소재의 첨가시, S.cereviase발효율은 대조대비 110%이상이였으며, C.utilis은 98%수준으로 나타나, S.cereviase의 경우가 C.utilis보다 효모발효율을 증대 시키는 것으로 조사되었다(P<0.01).
효모추출물의 경우, 굽기후 관능평가시 1% 이상 첨가시 우마미 및 짠맛이 다소 높게 나타났으며, 이때 첨가농도가 높을수록 빵 표면색의 증대(황갈색)에 기여하였다(P<0.01).
다. 제형별 구분 상업효모 대비 풍미발현 효과 및 인자를 조사하여 보았다.
순수효모는 기본적으로 풍미(특화성)에 미치는 효과는 없었으며, 특화성(풍미 : 카라멜향)에 관여하는 인자는 유기산(Tataric acid), Glucose 및 과일발효(유기산 및 Glucose 함유)였다. 압착효모는 최초(상업효모 : 1,986, 개발효모 : 1,689 기준) 대비 3시간 경과시 상업효모는 1.8배, 6시간이 경과시는 1.7배로 나타났으나, 개발효모는 1.7배에서 3.4배로 증가수치를 보였다. 건조효모는 최초(상업효모 : 1,615, 개발효모: 910 기준) 대비 3시간 경과시 상업효모는 1.6배 1.78배, 6시간이 경과시는 3.5배로 나타났으며, 개발효모 또한 1.71배에서 2.4배로 유의한 증가수치를 보였다. 전체 향기성분 중 알콜류 점유비율 조사결과, 압착형은 71~약 90%범위를 분말형은 59~82% 범위를 보여 제형에 관계없이 높은 점유율을 보였다. 효모균수 증감 및 시간별 먹이원 이용성과 연계성 평가에서는 동일 연계성을 갖는 것으로 판단되었다.
10. 사업성
최종 소비자 기호 충족형 제과제품을 구비하고 국내시장(기능성 제과제품 분야) 런칭 및 산업화 확대와 더불어 개발기술 KNOW-HOW 및 개발 소재의 이용성 다각화 (타 식품, 의영양품, 가축사양 등)를 통한 점진적 고부가가치 사업화 방향을 점진적으로 설정코 져 하였다.
가. 중장기 전략적 사업화 진행 로드맵 설정
- 1단계 : 지적소유권 확보(특허 출원 및 등록)후 학술발표
- 2단계 : 관련기관(식약청, 수과원) 기술컨설팅 실시
- 3단계 : GLP검정(천연물신약 분야 : 천연항균제)
- 4단계 : 선발효모 및 기능성소재 대량생산시스템 및 사업화 로드맵 설정
- 5단계 : 시제품 생산 및 시장 진출 본격화
나. 생산시설 구축 : 년간 효모 및 기능성소재 생산량, 연간예상판매액, 생산시설구축 예산, 소요대지
다. 시설디자인 : 예정(주관기관 승인후)
라. 홍보 및 마케팅실시(종료후 3년 소요예상)
11. 결론
가. 제과ㆍ제빵용 한국토종효모자원의 개발과 지적소유권은 확보되었다.
나. 선발효모에 대한 대량발효생산기술 정립이 완료되었다.
다. 선발효모에서 기능성 소재의 대량생산시스템 정립은 완료되었다.
라. 개발효모 및 기능성 소재에 대한 사전안전성 및 동물임상 실험을 통한 안전성 및 기초효능 평가는 완료되었다.
마. 개발효모 및 기능성 소재의 제과∙제빵 적용성 평가결과 확보 및 이를 토대로 한 제조레시피는 정립되었다.
사. 중장기 전략적 사업화 진행 로드맵(5단계) 설정이 완료되었다.
Ⅲ. The Results of Research and Development
1. Development of Korean native yeast resource for baking and application to baking(Result of preceding research)
The whole research was conducted connecting the KNOW-HOW secured through the result of discovering Korean native yeast and the
industr
Ⅲ. The Results of Research and Development
1. Development of Korean native yeast resource for baking and application to baking(Result of preceding research)
The whole research was conducted connecting the KNOW-HOW secured through the result of discovering Korean native yeast and the
industrialization related preceding research of the yeast(Project No : 109115-02, IPET), and the technology secured by preceding research can be summarized as follows.
A. Finished the selecting Korean native yeast for baking in the organic farming spot(fruit type) and securing genes
- Patent application No.(10-2009-0134773) : A baking preparation method for using Korean native yeast. (2009), Secure cell line(patent): Saccharomyces cerevisiae JKK091002(patent consignment No. : KCCM 11056P)
B. Finished the culture medium construction and culturing condition for mass production of selected yeast(based on frozen powder type yeast : production yield 5%), founding a mass production system(compressed yeast : 7,000 ton/year, based on frozen powder type yeast : production effeciency 5%) and industrialization related ROADMAP C. Now on the point of founding the making technique(recipe) of the development natural yeast applied specialized bread and commercialization of it
2. Replace commercial yeast with obtain Korean native Baker's yeast. (Obtain of genetic resources)
For additional selecting Korean native yeast resource and securing gene resource related to the result of preceding research, we separated and froze the yeast type and lactobacillus type after gathering 140 kinds of organic samples(fruit type, fruit-vegetable type, vegetable type, mushroom type etc.) from 62 organic spots. For the Korean native Baker's yeast selection, we established on culture medium and culture condition for yeast isolation. it was used 5% sucrose solution and than inoculation of the organic agricultural product outer layer of skin and tried culture(temperature : 30℃, humidity : 50 %) for three days. For yeast isolation, we tried culture of different time point culture medium with TSA, PDA and BCP nutrient agar medium. afterward confirmation colony of morphology to naked eye and microscope and than tried 3 times yeast isolation. Identification of yeast isolation was finished to use 1st API systeme, 2ed Vitek analysis systeme and 3rd Diversilab systeme. The finished whole process after commit to Macrogen company(Korea). Macrogen was tried to Identification of Gene cloning and confirmed genetic homology 99% through Chromatogram and Sequencing results comparison. As a result, The yeast which separated under organic agricultural product. we give a name to S.cereviase JKK091006 S.cereviase JKK091002, S.cereviase CKK110426 and S.cereviase OKK110427.
3. Established of production technique large development yeast.
We established on culture medium and culture condition and to be able to production system of maximize yeast productivity(growth and development elevation) and profitability for essential condition for economic production of natural derivation selection yeast. The established on essential items, the salt and alcohol tolerance strain selection, pre-treatment process design of selection culture medium raw materials, method design of high density culture , established optimization of compression yeast cultivation method and productive system construction by scale. Baker's yeast Productive fermentation technology and Product technology development results are as follows.
A. The selection of salt and alcohol tolerance strain
We confirm limit growing point as we culture it at 30 degrees, 200 rpm for one or two days as inoculation the Saccharomyces cerevisiae JKK091006 which cultured previously it to the PDB broth which NaCl 1~10% was included culture medium and we would raise salt density by steps, and we gave salt tolerance from this time. also we gave alcohol tolerance in ways to be similar too. and than stock of selection strain B. Pre-treatment process design of culture medium raw materials.
We analyzed growing pattern of yeast at fermentation tanks as we diluted suitably syrup(The Philippines, a sunflower organic farming) as we added ammonia(28%), phosphoric acid(85%), other mineral. also, we added the mineral which was additional so that I used an ICP analyzer, and the nutritious component which Baker's yeast needed can be contained a syrup underwear mineral component.
C. Designs and optimization of High density culture method
We used intermediate feeding strategy, constant feeding strategy for optimization production of pre-treatment optimization of syrup and natural derivation yeast and we developed a productive method to be most suitable in order to raise growing pattern expansion of yeast through method to increase a feeding speed etc. according to fed-batch optimization, other yeast growing.
D. Production and manufactures established of High-yield compression yeast Generally, we consider it about the merits and demerits that can occur from commercialization yeast, and than we tried to method to be able to ac complishment in laboratory levels. thereafter we confirmation can applicabil ity made bread. Showed to high density total cell count. such as culture medium was 2.5×109CFU/ml and compression yeast was 1.15×1010CFU/g. The productive yield certification results of develop culture medium a product, showed high productive efficiency such as 5.4% of freeze-dried yeast and 18% of compression yeast. We was established on develop a product of productive yeast classified it to dry and compression type.
E. Profitability obtain of productive construction system
We finished economy evaluation As constructions of productive system a profitability obtain and than classified it to 1,800 ton of Annual productive scale and Productive scale step was 5, 50, and 500ton.
4. Founding the mass production system of selected yeast for baking and functional material(4 phases)
This research utilized the advanced research result and consigned to Amicogen, Inc. which retains the culture facility and the related expertise of lactobacillus type and yeast germs. Then, this project made the trial and start product as well as establish the mass production system of selected yeast and functional material by dividing them into 4 phases.
A. Founding the selected yeast(Wild-Type) production yield increasing type culture medium and culturing condition(phase 1). By fulfilling the fermentation(5L jar fermenter) in the condition of culture medium and culturing(syrup culture medium) settled in advance targeting the 4 types of selected yeast and standard yeast(advance research), this project planned to confirm the optimized yeast selection and the condition for culture medium and culturing indicating the target production yield(based on freeze dried powder yeast : 5%). The result is as same as follows. As the result of the investigation of the compressed yeast (based on the 70% of moisture) production yield and the number of yeast germs per development yeast compared to fermented liquid, S.cereviase JKK091002 showed 20.8%, S.cereviase OKK110422 showed 19.4%, S.cereviase CKK111111 showed 16.8% and in the case of C.utilis, it showed the highest production yield as 35%. Compared the production efficiency after the freeze dry per selected yeast based on the fermented liquid. In the whold experiment area, it showed the production yield in 4%~5% range(based on the freeze yeast powder), and it showed the same suitability in the corrected condition of the culture medium and culturing(P<0.05).
B. Founding the mass production system of final selected yeast(phase 2)
Based on the result of the first certification, we selected C.utilis which showed more than 5% of production yield and S.cereviase CKK110426 which showed the best fermentation ability in baking applicability assessment, and certificated the commercial productivity in the middle-sized pilot scale(50L fermentaer) before the mass production system application. As a result, we confirmed the possibility of the mass production of selected yeast type showing more than 5% (based on the freeze dry)of the productivity in the same culture medium and the culturing condition.
C. Reserve founding the division technique of functional material in selected yeast(phase 3)
Based on the certification result in phase 1~2, targeting the yeast produced by the application of actual 10 tons of large fermentation production system, we certificated the productivity of yeast extract and cell-wall graduated material showing the maximum transference by autolysis(insert of protein decomposing yeast) of the smashed yeast and unsmashed yeast by cell smashing machine. As a result, it is confirmed that the production efficiency of yeast extract and cell graduation material is better when applying unsmashed yeast.
D. Founding the mass production system of functional material(cell-wall and extract) in selected yeast(phase 4)
Based on the result of phase 1~3, this project founded the mass production system of yeast extract powder and cell-wall graduation material.
5. Characteristic investigation of the development yeast manufacturing
A. The Different type of development yeast(dry or compression type) storage evaluation results by different period and temperature are as follows.
B. The Effective storage validity evaluation results showed that dry and compression yeast was under cold storage condition in 1 year or 1 month.
C. Numerical change of yeast: keep it on 1 month was showed the decrease of total cell number results until the maximum 20% without reference to storage temperature or type.
D. Change of state : As time passed and than occurred mold, browning reaction and a nasty smell(excepte of dry yeast).
E Investigation of the containing amount of functional material per development yeast
1) Amino acid making
We compared the amino acid composition(based on the 18 items of essential amino acid ) of the 5 types of development yeast(S.cereviase JKK091002, S.cereviaseCKK110426, S.cereviaseOKK110427 and C.utilis) compared to commercial yeast. As a result of comparison the whold amino acid content to commercial yeast(14.1%), it showed the difference that about 11% in the case of S.cereviase in the development yeast type, and 7.68% in C.utilis(P<0.05).
2) Investigation of the fundamental nutrient(total protein, crude fat, carbohydrate, ash and mineral content etc.)
Though the numerical difference of total protein, crude fat, carbohydrate and ash compared to commercial yeast was not accepted, as a result of the analysis of mineral(8 items : Ca, P, Mg, Fe, Zn, S, Se, Mn), generally C.utilis(based on 1) showed higher content of Mineral than S.cereviase.(Calcium : 26 times, P : 3.3 times, Mg : 3.2 times, Fe : 6.4 times, Zn : 4.2 times, S : 1.3 times, Se : undetected, Mn : undetected).
Generally, the mineral numerica value of development yeast showed higher than commercial yeast in the comparison in S.cereviase sample, it is considered as the trait of the division yeast germs in wildlife(P<0.05). That is, based on the calcium, the content difference is accepted as in the case of commercial yeast(Calcium content : 47ppm), S.cereviaseJKK091002 showed 170ppm, S.cereviaseCKK110426 showed 497ppm, and S.cereviaseOKK110427 showed 812ppm, it showed similar pattern in total mineral.
6. Advanced assessment of the characteristic and product applicability of each mass production functional material
A. Comparison investigation of the nucleic acid content
After the RNAase process of the yeast extract liquid that extracted from selected yeast, the nucleic acid type that is the functional material except for yeast extract contained 4 types(GMP, CMP, AMP, UMP), total nucleic acid showed the 20%~25% ranged content and the content ranged about 5% per the type of nucleic acid.
B. Investigation of the yeast extract molecular weight range
We tested the purity and the characteristic by comparing the water-soluble yeast extract among the mass production possible functional material in selected yeast(S.cereviase CKK110426) to the common yeast extract(contrast) and molecular weight(FPLC analysis System).
As a result, it retained the property of matter having more than 90% of same molecular weight range in contrast and comparison, and it was water-soluble ingredient. The reason why it showed the difference of molecular weight within 10% is judged as the difference of the type of extract yeast and the extract method.
C. Fundamental nutrient investigation(total protein, crude fat, carbohydrate, ash etc.)
The numerical difference of the total protein, crude fat, carbohydrate, ash of the functional material type(β-Glucan, yeast extract) compared to S.cereviaseOKK110427 was not accepted. However, we compared and analyzed the mineral type(12 items : Ca, Fe, Zn, Cu, Se, P, Mn, Mg, Pb, Cd, As, Cr). Based on the calcium content, the total mineral content of the cell-wall(β-Glucan) separated from yeast seemed slight. However, the total mineral figure in yeast extract showed similar figure as 1.08~1.27 times as S.cereviaseOKK110427(1,136ppm, based on 1). But the extra mineral content generally decreased(P<0.01).
D. Heat-safety assessment (dividing liquid and power type)
1) Yeast extract
We planned to forecast the safety and stability during application for cookie/breadbaking according to the heat safety certification result after separating the liquid(2%, w/w) and powder type per dividing functional material(cell-wall : β-Glucan, extract containing nucleic acid) compared to organic farm field selecting yeast(S.cereviase CKK110426). As a result, in the case of powder type, yeast extract except for β-Glucan induced the property change(maillard browning) after the high temperature. it is proportional to the temperature processing. However, liquid type showed no property change(maillard browning) and molecular weight change. Therefore, the liquid type process is accepted as more effective method for application than solid type.
2) Nucleic-acid type
When did the RNAase processing of the yeast extract from selected yeast, the nucleic type that is the functional material except for yeast extract contained the 4 types(GMP, CMP, AMP, UMP). Therefore, for the amplifying the baking application and the use of the functional material, we implemented the heat-safety certification in solid and liquid(2%, w/w) state. As a result, the solid and liquid type showed the property change(maillard browning) as the nucleic acid type original molecular structure is destroyed in more than 70℃ of high fever, it increased proportioanl to temperature.
E. The safety assessment of the yeast extract nucleic acid type(complex nucleic acid type) for long-and short-term storage(32 days, store in room temperature, liquid type)
The nucleic acid type in selected yeast and common yeast extract contains about types(CMP, UMP, GMP, AMP). Therefore, when storing the 5 types of nucleic acid type Mixer liquid written above based on the standard screen for long term(32 days, in room temperature, making 1% complex liquid per the type of nucleic acid), we planned to predict the safety and stability of effect based on the safety assessment(FPLC) when applied to product. As a result, the change of molecular weight was observed as change to low molecule according to long term storage in liquid type condition, it is judged that the nucleic type should be stored as the powder type, and be used as soon as possible when applied as liquid type.
F. Assessment of mineral interfering effect(chelating) in yeast separating sole and complex nucleic acid type
The selected yeast and common yeast nucleic acid in extract contained about 4 types(CMP, UMP, CMP, AMP), these nucleic acid type chemical structure contains the common structure which has the ribose 1 molecule and specific amino acid and P. And P of these is predicted to contain the chelating ability with mineral type, therefore we made each 5 types of complex nucleic acid type making liquid(2%, w/w) and sole nucleic acid type making liquid(2&, w/w) that the IMP is added just targeting Calcium(CaCl2), and then compared and certificated each of these in the heat-processed condition and un heated condition. The result is same as follows.
1) Complex nucleic acid type : After finishing the reaction to calcium chelating, the production yield(insolubilized precipitate freeze drying) was very low as within 5%, the gelation reaction was evoked because of the nuceic acid type and calcium or ion reaction in the same grade liquid after the heat processing.
2) In the result of the each certification(the result of the ICP analysis of insoluble nucleic acid type) of only sole nucleic acid type to confirm the result of the complex nucleic acid type, it showed the difference of the chelating ability to calcium in the order of AMP (81.5%) > GMP(74%) > IMP(70%) > 혼합(3.6%) > CMP(1.2%). Later, the careful certification of chelating reaction per mineral to each nucleic acid type is judged as necessary.
7. Advanced safety test of the development functional material
We finished the advanced founding of the safety test technique using Sialic acid which was donated by the ㏇ Maeil dairy industry central laboratory (purity : 98%), as the barometer for the advanced test of the wide safety spectrum per the selected yeast origin functional material, concentration. Moreover, we tested the advanced safety for selecting the optimum concentration range through the MTT, NO examination using the RAW264.7(macrophage cell) cell mainly for the 5 types of nucleic acid which are contained in the yeast extact and inside of it as the selected yeast originated functional material. For this, Set the nucleic acid type(5 types : GMP, UMP, CMP, AMP, IMP) with same amount of the content in yeast extract as the sole(AMP, IMP) and complex nucleic acid type(GMP+UMP+CMP) handling category, and planned to predict the basic function assessment relating the anti-inflammation index(NO) and toxicity index(MTT) investigation result when processing per concentration(No treated, 0.5%~1.0%, w/w) The result is same as follows.
A. The growth acceleration of the cell(MTT) along with the antiinflammatory effect(NO) of IMP of the nucleic acid type after the process of more than 0.5% was accepted simultaneously, and APM was confirmed that it is effective to cell growth than antiinflammatory effect in the concentration of more than 0.5%(P<0.01).
B. When it coms to the barometer cell strain of the functional material type, the toxicity induce(MTT) related concentration range was 0.5%~2% and the concentration which showed the antiinflammatory(NO) effect was 0.5%~10%.
1) Among the cell toxicity(MTT) inducing material and concentration, UMP and CMP was the highest as 0.5%, the second is yeast extraction, AMP and IMP process group, and commonly 0.75%. The 5 types of the mixed nucleic acid type processed group was 1% and GMP processed group showed the toxicity when added the concentration of more than 2%.
2) The significance of the antiinflammatory(NO) effect was accepted after the concentration process of 0.5% in the case of the yeast extract, 2% in GMP process group and more than 10% in CMP process group, and extra material was not accepted(P<0.05).
C. Overall, the case of the yeast extract was confirmed as the best material and it was finally confirmed that the safety was secured the complex functionality such as the decline of the antiinflammation when the additional concentration was ranged from 0.5% to 1%, 1~2% as the 5 types of mixed nucleic acid processed group, more than 2% in GMP and more than 10% of concentration in CMP .
Based on the result writtenn above, we set the optimum concentration as 0.5%~1% to certificate the aimed effect(security) during the assessment of animal clinical experiment and baking applicability.
8. Animal clinic test(Safety and basic functional test)
A. Making feed for animal clinic based on the MIC set
1) The overall composition for safety test throught the functional material animal clinic test : the control group using AIN-76A as basic feed, 2 comparison groups(5 types of mixed nucleic acid, Yeast NT) and 2 experiment groups(β-Glucan, Aromild), each concentration was mixed and constructed as 1%(L;low), 5%(M;Medium) and 10%(H;High)(β-Glucan was constructed as 0.1%,0.5% and 1%)
2) The feed recipe of overall experiment group composed with 2 comparison groups(5 types of mixed nucleic acid, Yeast NT) and 2 experiment groups(β-Glucan, Aromild), and each concentration was mixed and constructed as 1%(L;low), 5%(M;Medium) and 10%(H;High)(β-Glucan was constructed as 0.1%,0.5% and 1%), using AIN-76A as the basic feed. Comparison group was added the nucleic acid to the basic feed, analyzing the nucleic acid content of the Aromild(trade name, KOHJIN company in Japan)(CMP 7.1%, UMP 8.9%, GMP 5.3%, IMP 3%, AMP 0.7%) which is the separated and extacted material of C. utilis. And we applied Yeast NT(trade name, KOHJIN, Japan) which is the separtaed and extracted material from C. utilis to base feed. Experiment group applied ß-Glucan (㏇ Oriental, Japan)which is the S. cereviase separated cell wall and the Aromild(trade name, Japan KOHJIN company) which is separated and extrated from C. utilis to the base feed.
B. Animal safety assessment through the long-and short-term eating(totally 8 weeks)
We investigated by the safety test item under the condition of growth and butchery after each 4 weeks, 8 weeks of the experiment animal's free intake of constructed feed. The main test was constructed by 8 items which are feed efficiency(Growth), weight(whole weight and per organs), histopathologic per organs, investigation of blood index and chromosome disorder and whole microbes in intestine by organs and fecal.
1) Investigation of growth rate and intake rate by schedule
There was no difference, when compared the daily growth rate(measured for 8 weeks by 24 hours) to 2 comparison groups(5 types of mixed nucleic acid, Yeast NT) compared to control group(mouse which ate AIN-76A) and 2 experiment groups(β-Glucan, Aromild)(P<0.01).
2) The change of the total weight and weight per organ
We divided the influence on the weight change of body weight and organs by the term, and compared the 2 control, comparison groups(5 types of mixed nucleic acid, Yeast NT) and 2 experiment groups(β-Glucan, Aromild).
As a result, in the whole experiment groups of the body weight and muscular tissue(5 organs : Liver, Kidney, Spleen) and osseous tissue(1 : femur), the difference of the size of spleen in control group(based on the weight 1, 0.009) compared to the comparison and experiment group(0.003~0.006) was accepted regardless of the term and concentration, the weight difference of liver, kidney and thigh bone was not accepted(P<0.05).
3) Investigation of blood abnormality and the physiochemical index
Based on the safety result related to growth of the functional material, we did additional investigation of the safety result in body through the test of blood forming and chromosome disorder, the risk of infection was judged as possible after 4 weeks through the hematological index because of the decline of the white blood and lymphocyte, however, as a result of the re-measurement after 8 weeks, there was no disorder in immunity homeostasis maintain of the mouse, and the toxicity which has the amount that recover the damaged liver cell in the Yeast NT and nucleic aced was confirmed through the blood physiological index. And we confirmed no abnormality in other main organs and diseases. Also, we reconfirmed that there was no disorder in the chromosome of mouse which ate the functional material through the MN analysis(P<0.05).
4) Assessment of the whole change of microbes in intestin
We confirmed whether the development functional material induces the whole change of microbes in intestine according to concentration and intake period(4 weeks and 8 weeks) under the aerotropic condition dividing whole numbers of germs(TSA culture medium) and colon bacillus plot(MacConkey culture medium) and lactobacillus(BCP culture medium).
As a result, As the mouse grows, observing the distribution of microbes in intestine of the contrasting comparison group and experiment group, though the number of colon bacillus and lactobacillus increases the increase of the distribution of the microbes in intestine of the compare and contrast mouse shows that lactobacillus tends to be more sizable than the colon bacillus when continuously intaking the functional material, the level is not the matter when it comes to statistics.
Therefore, as a result of the analysis of the distribution of the microbes through the animal clinic test based on the test by functional material, safety per concentration and basic function, we confirmed that the intaking the functional material showed no difference from the compare group even in the concentration of more than 1% when applying to baking product.
5) After intaking the nucleic acid during the animal clinic test
When 2 days passes after intaking the nucleic acid during the animal clinic test, the sexual violence was shown, therefore it can be predicted that the result would be shown as different from the barometer result. Thus, as confirming the positive or negative body reaction result which follows the intake of nucleic acid type per concentration, we planned to settle the direction of the test of baking applicability to product and related manufacture research based on the result of the experience above.
A) Started the histological verification extracting the testicles of the compare group and process group(Low, medium, high dosage) which ate just base feed, the spermatgonal which is related to the sperm forming in curly seminiferous tubule and even the sperm cell were all observed in case of the compare group, the sperm forming process in the seminiferous tubule of the experiment group was observed as the interior of the seminiferous tubule seems hollow because the process of the sperm release was superior.
B) Following the intake of the nucleic acid, this result is judged as the sperm release was put first than the normal feeding activity and the priority would lead to the change of the reproductive behavior. To confirm those result more accurately, the necessity for investigating the sexual-related hormone change pattern more accurately with the additional investigation of time and related hormone came to the fore.
9. The result of the assessment of the baking applicability of development yeast and functional material
We carried out the baking applicability of the functional material(4 types of Mix necleic acid type) based on the result of the advanced security and functionality by the development functionality material(anti-inflammation increasing effect, cell toxicity and growth related assessment), and we evaluated the baking applicability by selecting "French bread" as a optimum sample after the reserve applicability assessment of the 24 items of cookiebaking field that the common recipe is well-known and the 24 items of breadbaking.
A. Set the cookie/bread making recipe
The result of the final cookie/bread making recipe according to the addition condition and simultaneous addition of the sole development yeast and sole functional material is same as follows(criteria : French bread). Development yeast applied general recipe : required amount of material[strong flour 1,000g + water 600g + compressed yeast 50g(powder yeast 25g) + salt : 18g] -> dough making(advanced stage of the final) -> the first fermentation(30℃, moisture : 80%, 30 minutes) -> division(270g) -> intermediate fermentation(30 minutes, room temperature) -> patterning(rod-type and circular type) and panning -> the second fermentation(30℃, moisture : 80%, 40 minutes) -> baking : 200℃/180℃(25℃). Development yeast and functional material simultaneous applied recipe : required amount of material[strong flour 1,000g + water 600g, compressed yeast 50g(powder yeast 25g) + salt : 18g+ each material 50g(5%, w/w)] -> dough making(advanced stage of the final) -> the first fermentation(30℃, moisture : 80%, 30 minutes) -> division(270g) -> intermediate fermentation(30 minutes, room temperature) -> patterning and panning -> the second fermentation(30℃, moisture : 80%, 40 minutes) -> baking : 200℃/180℃(25℃). In the baking applicability assessment about the 4 types of trial development yeast(based on plain bread), the 3 types of S.cereviase including C. utilis are evaluated as suitable to bread application(fermentation percentage and commercializing ability) compared to common yeast(P<0.01).
B. Fermentation characteristic comparison according to the addition of development yeast and functional material(Comparison of fermentation percentage by each fermentation phase)
1) Development yeast part
As a result of the baking applicability assessment, the yeasts that can be simultaneously used for making cookie/bread and functional material are 3 types of yeast(S.cereviase JKK091002, S.cereviase CKK110426, S.cereviase OKK110427) and C.utilis is suitable to make functional material(P<0.01). The 4 types of yeast that is finally selected through the baking applicability assessment is on the process of securing patent(gene).
2) Functional material part
When added yeast cell-wall separating sample, the fermentation percentage is about 80% of the contrast and comparison. When added the yeast extract material, the fermentation percentage of S.cereviase is more than 110% of contrast and comparison, C.utilis showed the level of about 98%, therefore the case of S.cereviase increases the yeast fermentation percentage than C.utilis (P<0.01). In case of yeast extract, umami taste and salty taste was higher when adding more than 1% of extract during the organic assessment after baking, and then the higher the addition concentration the more contributed to increasing of the surface color of bread(light brown(P<0.01).
D. We tried to investigate other flavor revelation effect for commercial yeast There wasn't effect that pure yeast wascause to flavors (specialization).
Organic acid(Tataric acid), Glucose and fruit fermentation a factor to participate in to specialization(flavor:caramel). The first(Commercial yeast 1,986,development yeast 1,689) Compression yeast in case of 3 hours process of time. Commercial yeast was appeared with 1.8 fold of 3hours after and 1.7 fold of 6hours, but development yeast was showed the increase numerical value rose with 1.7 to 3.4 fold. The first(Commercial yeast 1,615,development yeast 910) Compression yeast in case of 3 hours process of time. Commercial yeast was appeared with 1.6 or 1.78 fold of 3hours after and 3.5 fold of 6hours, and development yeast was showed the increase numerical value rose with 1.71 to 2.4 fold. It was the type of alcohol occupation ratio investigation results during total fragrance components. such as dry yeast showed 59-82% range, and compression yeast was 71~ 90% range. It was showed high position regardless of type. Connectivity result of bread fermentation rate, increase or decress numerical yeast and yeast consumed : It was confirmed same connection.
10. Commercialization
Planned to set the gradual high value commercialization direction through purchasing final consumer palability satisfying baking product, launching in domestic market(functional baking product field) and usability diversification of development technolo효 KNOW-HOW as well as magnifying(other food, medicine and nutrition supplies, stock keeping etc.)
A. Set the strategic commercialization progress road map for mid-and long-term
- phase 1 : Conference after securing patent ownership right(patent application and registration)
- phase 2 : Conduct the technology consulting with related institutions(KFDA, QIA)
- phase 3 : GLP certification(natural new drug field : natural bactericides)
- phase 4 : Set a road map for the mass production of selected yeast and functional material and commercialization
- phase 5 : Producing trial and fully-scaling the market entering
B. Constructing production facility : An output of yeast and functional material per year, expected sales per year, expected budget for production facilities, consumed land
C. Facility design : expected(after the approval of supervising institution)
D. Conducting advertising and marketing(Expecting consuming 3 years after finish)
11. Conclusion
A. Development of Korean native Baker's yeast resources Korean substitute commercial yeast and Intellectual Property Right were ensured.
B. Technical fermentation for Baker's yeast production technology development was finished.
C. Finished founding mass production system of functional material from selected yeast
D. Finished assessment of preceding security, security assessment through animal clinical experiment and basic effect assessment about development yeast and functional material
E. The baking applicability assessment result of development yeast and functional material is secured and the making recipe based on the result.
F. Setting of a middle- and long term strategic commercialization progress roadmap(the 5th stage) is finished.
과제명(ProjectTitle) : | - |
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연구책임자(Manager) : | - |
과제기간(DetailSeriesProject) : | - |
총연구비 (DetailSeriesProject) : | - |
키워드(keyword) : | - |
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연구목표(Goal) : | - |
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