[보고서]분자생물학적 개량을 통한 고효율 이산화탄소 고정 미세조류 개발

보고서 정보

주관연구기관

한양대학교
HanYang University

보고서유형

1단계보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2014-07

과제시작연도

2013

주관부처

미래창조과학부
Ministry of Science, ICT and Future Planning

등록번호

TRKO201400028252

과제고유번호

1345203437

사업명

기후변화대응기술개발

DB 구축일자

2014-11-22

키워드

이산화탄소 저감.해양미세조류.광합성.광에너지 전환효율.광수확.돌연변이체.안테나 축소.CO2 mitigation.microalgae.photosynthesis.light energy conversion efficiency.light harvesting.mutant.antenna truncation.

DOI

https://doi.org/10.23000/TRKO201400028252

표 광전환 과정에서 손실되고 난 이후의 biomass를 계산한 것을 나타낸 다. 광전환율의 이론적 최대치는 C3 식물의 경우 4.6%이고 C4 식물 의 경우 6%이다
표 안테나가 축소된 돌연변이주는 불필요한 빛 에너지의 흡수가 일어 나지 않아 낮은 광도에서도 야생종보다 높은 광합성 효율을 나타내 고, 빛의 투과를 증가시켜 밀도 높은 배양이 가능. 돌연변이주에서 높은 광합성 효율을 나타냄.
표 특정 항생제(Paromomycine)에 대한 저항성을 갖고 있는 벡터를 사용한 Insertional mutant library의 제작 과정
표 (A) Paromomycine 저항성 유전자가 들어있는 벡터구조 (B) 완성된 Library의 예 (C) Insertional mutant library를 구축하는 실험 과정
표 형광분석장비 (Imaging PAM)을 이용한 광전환 효율 우수 돌연변이 고속 스크 리닝 과정
표 (A) Imaging PAM을 이용한 광합성 효율이 증대된 돌연변이를 선별하기 위 한 스크리닝 과정. (B) 최종 후보균주를 대상으로 Imaging PAM을 이용한 형광 분석법을 이용하여 광합성 효율 측정.
표 선발된 광합성 우수 돌연변이 후보군에서 NPQ와 qP의 상관관계
표 Chlorophyll a/b ratio를 측정하여 antenna 돌연변이 균주 탐색
표 HPLC를 이용한 pigment analysis를 통한 광합성 색소 돌연변이주 탐색
표 선발된 돌연변이 (MK-4, 16, 28, 32)의 색소 분석 결과
표 PAM을 이용하여 다음과 같이 control가 비교하여 qP가 높고 NPQ가 낮거나 혹은 반대의 특성을 보이는 돌연변이 균주 screening.
표 Imaging PAM을 이용하여 돌연변주와 contorl 사이에서 광합성 효율의 대표적인 parameter인 qP와 NPQ를 비교.
표 총 9,216개의 JK mutants libraries를 PAM을 통해 두 차례 스크리 닝하여 control 대비 NPQ가 낮고 qP가 높은 특징을 갖는 62개의 mutants와 특이적인 형광패턴을 갖는 21개의 mutants를 선발하였다.
표 좁혀진 후보군 83개를 대상으로 HPLC를 사용하여 3차 screening을 진 행. HPLC 분석을 통하여 Chlorophyll a/b ratio와 pigment 구성 및 특이적 변화를 확인하여 후보군을 좀 더 좁혀나갔다.
표 HPLC의 정성 분석 결과로서 control과 돌연변이균주의 색소 구성 비교. JK4-7의 경우 lutein 합성이 일어나지 않은 결과 를 보였고, JK5-22 균주는 control에 비하여 chlorophyll b 의 peak 크기가 줄어들었으며 JK11-40 균주는 chlorophyll b가 발견되지 않았다.
표 Control 대비 특이적인 양상을 보이는 JK4-7, JK5-22의 색소 분석 결과
표 광합성 우수 후보군들의 Photosynthesis-Irradiance curve. chloropyll을 기준 으로 했을때의 산소발생량과 세포수를 기준으로 했을 때의 산소 발생량을 각각 구 하였다.
표 선발된 광합성 우수 후보군의 Photo-heterotrophic growth 1차 측정
표 선발된 광합성 우수 후보군의 Photo-heterotrophic growth 2차 측정
표 고속 성장 후보군 스크리닝 선발 결과 종합
표 선발된 광합성 우수 후보군의 Photo-Autotrophic growth 1차 측정-set 1
표 선발된 광합성 우수 후보군의 Photo-Autotrophic growth 1차 측정-set 2
표 선발된 광합성 우수 후보군의 Photo-Autotrophic growth 1차 측정-set 3
표 선발된 광합성 우수 후보군의 Photo-Autotrophic growth 2차 측정
표 최종 선발된 고성장 후보군에서 NPQ와 qP의 상관관계
표 건조중량을 기준으로 실제 biomass의 증가량을 측정한 결과. Control 대비 최대 150.56%의 증가한 Biomass 고속증대 후보군 총 5종을 선발하였다.
표 Biomass 증가량을 바탕으로 광전환 효율을 측정한 결과. Control 대비 최대 5.27%의 증가한 광전환 효율 증가 후보군 총 5종을 선발하였다.
표 Optical density 측정을 통해 돌연변이 균주 83개 중 A set의 성장률을 측정한 결과. 대조군은 검은 점선으로 표시되어 있다.
표 Optical density 측정을 통해 돌연변이 균주 83개 중 B set의 성장률을 측정한 결과. 대조군은 검은 점선으로 표시 되어 있다.
표 Optical density 측정을 통해 돌연변이 균주 83개 중 C set의 성장률을 측정한 결과. 대조군은 검은 점선으로 표시되어 있다.
표 Optical density 측정을 통해 돌연변이 균주의 성장률을 측정한 결과. 총 83개의 돌연변이 균주를 3개의 그그 룹으로 나눠 1차로 실험을 진행한 결과 대조군(검은 점선)보다 높은 성장률을 보인 19개의 균주를 대상으로 2차 스크리닝을 진행하여 위와 같은 결과를 얻을 수 있 었다. 최종적으로 대조군 대비 높은 성장률을 보인 JK12-12를 선발할 수 있었다.
표 최소배지에서의 JK12-12 균주와 대조군 (CTR) 의 성장곡선과 Dry cell weight (DCW) 측정 결과. JK12-12의 성장률은 대조군 대비 최대 139% 높고, biomass는 최대 130% 높은 결과 를 얻었다.
표 돌연변이 균주와 대조군의 산소 발생량 측정 결과. JK5-22와 JK9-18은 각각 대조군 대비 242%, 213% 높은 산소 발생량을 보였다.
표 다양한 배지 조성에서 돌연변이 균주와 control를 비교하여 세포 수와 건조중량 (Dryweight)을 측정하였다.
표 그림 37 돌연변이 균주와 대조군의 산소 발 생량 측정 결과. JK5-22와 JK9-18은 각 각 대조군 대비 242%, 213% 높은 산소 발생량을 보였다.
표 광전환 우수 후보군을 대상으로 한 Southern blot 결과
표 Control과 MK4 돌연변이체의 HPLC 결과와 색소 구성 비율의 차이
표 Low light과 High Light 조건애서 Total Chlorophyll, Chlorophyll A to B ratio, deepoxidation state, Xanthophyll cycle pigment pool의 변화
표 Control과 MK4 돌연변이체의 산소발생률 곡선
표 MK4 돌연변이체에서 insertional event가 일어난 위치
표 Imaging PAM을 이용한 형광측정 결과, 형광유도곡선과 NPQ, qP data
표 Low light과 High Light 조건애서 Total Chlorophyll, Chlorophyll A to B ratio, deepoxidation state, Xanthophyll cycle pigment pool의 변화
표 MK24 돌연변이체에서 insertional event가 일어난 위치와 target 유전자의 mRNA 발현 분석
표 형질전환 시 사용한 벡터와 Southern blot 결과. 왼쪽에서부터 순서대 로 SmaI, NcoI, P stI의 제한효소를 사용하여 실험을 진행하였다. 총 7 개의 돌연변이 균주 중에서 6개의 돌연변이 균주가 한 개의 벡터가 삽입 되었음을 확인하였다.
표 다양한 돌연변이 균주에서 실행한 genome walking 실험 결과. 각 돌연변이에서 외래유전자의 위치 확인 및 knockout된 유전자를 찾 을 수 있었다.
표 돌연변이 균주의 insertion PCR 결과. 다양한 primer를 조합하여 ①, ②, ③의 PCR을 진행하였을 때 삽입된 벡터의 위치를 재확인할 수 있었다.
표 gDNA 상에서 벡터의 삽입 위치를 확인한 결과
표 타겟 유전자의 RNA 발현 양상을 비교 하는 RT-PCR 결과. 대조군인 CTR(control)와 돌연변이 균주 JK5-22에서 RNA 발현을 비교하였다.
표 돌연변이 균주 JK5-22의 표현형 분석 및 유전형 분석 결과.
표 돌연변이 균주 JK9-18의 표현형 분석 및 유전형 분석 결과.
표 돌연변이 균주 JK5-44의 표현형 분석 및 유전형 분석 결과.
표 Dunaliella salina CCAP19/18과 Dunaliella salina zea1 의 광학현미경 사 진
표 (A) EMS의 구조 도식화, (B) EMS의 작용 원리
표 돌연변이체 선발과정
표 (A) Neochloris oleoabandans의 cell 사진, (B) N. oleoabandans와 C. reinhardtii cw15의 성장곡선. d: 배양일수
표 (A) N. oleoabandans의 염화암모니움 (질소 원)의 농도에 따른 성장곡선. (B) 자가영양환 경에서 자라는 N. oleoabandans의 성장곡선.
표 Chlorella spp.와 Neochloris oleoabanduns 의 성장 곡선, d: 배양 일수, Td= 약 5 시간
표 TAP media에서 키운 N. oleoabandans에 EMS를 처리 한 후 선별된 돌연변이 후보들을 액체배지에 키워 선별 실험 을 진행 중임.
표 (A) HS media에서 자라는 N. oleoabandans에 EMS를 처리한 후 선별 된 돌연변이 후보 (500여개), (B) N-source 제거한 HS media에서 키운 N. oleoabandans를 이용하여 EMS 처리
표 EMS mutagen 처리 후 D media를 포함하는 agar plate에서 눈에 띄는 색을 나타내는 클론을 분리하여 배양
표 돌연변이주의 형태적 특징으로써 붉은 색의 색소를 축적하면서 야생종보다 약간 더 둥근 형태를 가짐
표 돌연변이종(mut)은 고광도(200, 400μE)에 노출 시에 D. sal. CCAP19/18 야생종(WT)이나 D. bardawil(bar)보다 많은 베타 카로텐을 축적한다.
표 각 strain들의 각각의 광도에서 Dunaliella CCAP19/18 야생종과 돌연변이의 생장률 비교
표 다양한 광도 (18-400μmol photons·m-2·s-1)에서 배양한 균주들의 산소 발생량 측정
표 PAM (pulse amplitude modulaation)을 이용한 엽록소 형광 측정.
표 광합성 효율을 비교하는 parameter중의 하나인 Fv/Fm값의 비교: 야생 종과 D. bardawil은 Fv/Fm이 광도의 증가와 함께 감소하지만 돌연변이 종에서는 거의 일정하게 유지되고 있다.
표 photosystem II의 전자전달 효율 parameter인 ΦPSII값의 비교
표 (A) 같은 수의 세포 당 돌연변이주의 베타 카로틴 함량이 고광도에서 월등히 높다. 베타 카로틴을 많이 축적하는 D. bardawil은 세포의 크기가 D. sal. CCAP19/18 보다 훨씬 큰데도 불구하고 세포 당 베타 카로틴 함량이 그다지 높지 않다. 더욱이 돌연변이종의 빠른 생장량을 고려하면 나머지 두 strain의 약 3배에 달하는 베타 카 로틴을 세포 내에 축적하기 위하여 훨씬 효율적인 광합성을 수행할 것으로 예상된 다. (B) chlorophyll 함량에 대한 베타 카로틴의 함량은 세 strain에서 비슷하나 세포 당 높은 함량의 베타 카로틴 함량에도 불구하고 chlorophyll 기준으로 비슷한 베타 카로틴 함량을 가지는 것은 돌연변이종에서 고광도에서도 엽록소의 함량이 줄 지 않았음을 나타내는 것으로, 고광도에서도 다른 균주들과는 달리 효율적인 광합성 을 수행할 수 있다는 것을 보여준다.
표 일반 배양조건이었던 100 μmol photons·m-2·s-1에서 돌연변이종은 야생종보다 베타카로틴 함량이 높다.
표 Mutagen인 EMS처리 후 살아남은 돌연변이의 색소구성을 HPLC를 이 용하여 비교분석 하여 대조군보다 클로로필 a/b 비율이 높은 돌연변이 균주 선발하였다.
표 형질전환 후 선발된 Chlamydomonas clone들 의 PCR (A) 과 Southern blot (B)을 통한 genome상 의 luciferase 유전자 삽입 확인
표 Dunaliella sp. 유래의 CBR promoter의 모식도. Dunaliellasp. 유래의 CBR 프로모터 중 light responsive element로 추정되는 부분과 promoter assay를 위한 fragment design을 위해 primer로 사용한 부분을 표시
표 Promoter assay를 위한 점차적으로 결손시킨 CBR promoter::LUC construct를 제작하고 원래 벡터에 있던 AR promoter를 X baI과 EcoRI으로 잘라내어 1,700bp, 800bp, 400bp, 100bp의 CBR 프로모터로 대체
표 여러 길이의 프로모터 (1,700bp, 800bp, 400bp, 100bp)의 광도에 따른 induction 정도의 비교결과
표 Induction 조건(high light)으로부터 저광도(LL), 암조건(dark)으로 옮겼을 때 reporter 유전자 발현의 회복정도. LIP 프로모터가 induction을 시키는 조건의 광도 (600μmol photon m-2s-1)에 60분 노출시킨 후 다시 LL (일반 배양 광조건, 50 μmol photon m-2s-1), dark로 각각 옮긴 후 luminescence의 회복정도 비교.
표 CBR 프로모터의 light specificity를 나타내는 결과
표 광도에 따른 CBR:LUC Chlamydomonas transgenic stain에서의 LUC와 LHCII 의 발현양 비교
표 LIP (CBR) 프로모터 시퀀스에서 기존에 밝혀진 light responsive element들을 표시한 결과로 GT-1 like, SORLIP 등 고등식물에서 알려진 element들의 발현 확인.
표 Dunaliella LIP 프로모터의 광유도 발현 기작을 밝히기 위한 Vector 제작
표 PCR을 통해 새롭게 제작된 Vector의 길이를 확인
표 LIP 프로모터의 light intensity에 따른 inducibility
표 100p와 300p 사이의 LIP 프로모터의 광유도 발현 기작을 밝히기 위한 Vector 제작
표 LIP 프로모터의 light intensity에 따른 inducibility
표 LIP promotor에 존재할 것으로 예상되는 특장 element의 결합 위치 예상
표 Dunaliella LIP 프로모터를 사용한 벡터 시스템에 CBR 유전자를 삽입한 construct
표 LIP 벡터 시스템으로 확보한 형질전환체와 Imaging PAM 결과.
표 CBR anntibody를 사용하여 CBR 단백질의 발현 여부를 확인한 western blot 결과. 4.5M에서 배양한 D . sp에서 발현한 CBR을 positive control로 사용하였고 nic 7- strain은 CBR이 발현하지 않는 negative control로 사용 하였다.
표 LIP promoter를 이용한 NAB1 유전자의 발현 조절
표 산업균주 Dunaliella의 형질 전환 실험
표 CnAFP의 구조 및 point mutation 위치
표 CnAFP의 point mutation 결과 얻은 mutants 간의 TH 활성 비교
표 각각의 동결보존제를 사용하였을 때 생존하여 계수된 세포 수와 세포 생존율
표 각각의 동결보존제에 따른 세포의 배양 사진
표 새로운 동결보존제인 CPA를 사용하여 6개월 동안 장기 동결보존을 하였을 때 생존하여 계수된 세포 수와 세포 생존율
표 -70도에서 일주일 간 동결보존한 후 계수된 세포 수와 생존율, 세포 사진
표 -70도에서 한 달 간 동결보존한 후 계수된 세포 수와 생존율, 세포 사진
표 -70도에서 6개월 간 동결보존한 후 계수된 세포 수와 생존율, 세포 사진
표 D. bardawil를 -196도에서 일주일 간 동결보존한 후 계수된 세포 수와 생존율, 세포 사진
표 D. bardawil를 -196도에서 6개월 간 동결보존한 후 계수된 세포 수와 생존율
표 안테나 변이균주들의 엽록소 a/b 비율과 엽록소 함량의 상관관 계. 광합성의존적으로 배양한 균주들을 배양농도를 측정한 후, 하 베스트하여 아세톤 용매를 이용 색소를 추출하고, 흡광분석법을 이용 엽록소 a 와 b의 양을 정량하였다. 정상균주 (삼각표지)과 비교할 경우, 대다수 변이균주 (다이아몬드표지)들이 높은 엽록소 a/b비율과 함께, 줄어든 세포당 엽록소양을 확인할 수 있다. 또 한 tla변이체 (사각표지)들과 비교할 때, 상대적으로 높은 세포당 엽록소양을 유지하고 있음을 알 수 있다.
표 정상균주와 비교한 상대적인 광에너지 전환능력. 고성능 형광비디오 분석기기를 활용하여 제한적인 광량조건 (80 mmoles/m2/ s)과과도한광량조건( 350mmoles/m2/ s)에서 배양한균주들의Fv/Fm 수치를 측정다. 전체의 70%의 안테나변이 균주들이 과도한 광량조건에서 광에너지 전환능력이 더 높음을 확인다.
표 정상균주와 비교한 광저해율. 고체 배지에서 배양한 안테나 변이균주 (파랑)를 제한적인 광량조건 (50 mmoles/m2/s)에 서과도한 광량조건(300 mmoles/m2/s)으로 옮기기 직전과 5 시간 이후에 Fv/Fm 값의 변화를 측정하여 광저해량을 측 정했다. 기존의 tla균주들 (빨강)의 광저해량은 정상균주에 비해 2배 가량 증가했으나, 본 연구의 안테나 변이균주는 평균 81.3%로 감소한 광저해량을 보였다.
표 디에폭시크산토필 정량분석. 액체배지에서 배양한 안테나변이균주 (연 두, 파랑)들과 정상균주 (노랑, 빨강)를 제한적인 광량조건 (50 mmoles/m2/s,LL)에서과도한광량조건(250 mmoles/m2/s, HL)으로 옮기기 직전과 12 시간 이후에 세포들을 하베스트하고, 90% 아세톤으로 추출한 색소들을 HPLC를 이용해 정량했다. Antheraxanthin과 Zeaxanthin을 합한 값을 전체클로로필a 값으로 표준화했다. 주어진 값은 두 번 수행한 결과의 평균과 표준편차이다.
표 Chlamydomonas reinhardtii 9개 자연종과 실험실균주 (cc125)사이의 유전변이분석
표 QTL메핑용 균주선택을 위한 단백질 변이량의 균주별 분포. J356-J6 교배조합을 메핑에 도입할 경우 (왼쪽 아래), 총 40,657개의 아미노산 신호변화를, cc2937-cc2931 교배조합의 경우 (오른쪽 아래), 총 40,803개의 아미노산 변화를 포함하는 QTL집단제이 가능하다. 이는 9개 균주 전체에서 발견되는 총 62,708개의 아미노산 중 65%에 해당 한다.
표 자연균주 9종 (N2-N10)과 실험실균주 1종 (N1, cc125)에 대한 질소고갈에 의한 광전환능력 변화분석. Myxotrophic조건에서 액체배양한 균주들을 mid-log시기 (~5E6 cells/mL)에 하베스트한 뒤, 질소가 들어있지 않은 배지로 치환후, 제한광량 (위쪽)과 과도광량조건(아래쪽)에서 7일간에 걸쳐 광전환 능력의 감소를 Fv/Fm 값을 통해 확인했다. N1, cc125; N2, cc1690; N3, cc2937; N4, cc2931; N5, cc2932; N6, J6; N7, J356; N8, S1D2; N9, cc2343; N10, cc2936.
표 1차년도 연구목표 달성도
표 2차년도 연구목표 달성도
표 3차년도 연구목표 달성도

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