초록 ▼

연구의 목적 및 내용
이 연구의 목적은 벼 도열병균의 병원성에 관여하는 유전자들의 기능을 규명하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 우선적으로 지난 연구에서 생산된 ATMT mutant library를 활용하여 이들 중 아직 삽입위치가 밝혀지지 않았고 병원성이 저하된 것으로 밝혀진 형질전환체를 대상으로 T-DNA 삽입 부위를 밝히고 이들의 유전형을 분석하기로 하였다. 두 번째로, 벼 도열병균 M. oryzae를 위해 가장 효율적으로 transcrpt를 늘릴 수 있을 가능성이 있는 T-DNA activation-tagging 시스

연구의 목적 및 내용
이 연구의 목적은 벼 도열병균의 병원성에 관여하는 유전자들의 기능을 규명하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 우선적으로 지난 연구에서 생산된 ATMT mutant library를 활용하여 이들 중 아직 삽입위치가 밝혀지지 않았고 병원성이 저하된 것으로 밝혀진 형질전환체를 대상으로 T-DNA 삽입 부위를 밝히고 이들의 유전형을 분석하기로 하였다. 두 번째로, 벼 도열병균 M. oryzae를 위해 가장 효율적으로 transcrpt를 늘릴 수 있을 가능성이 있는 T-DNA activation-tagging 시스템을 구축하고, 이렇게 확보된 시스템을 활용하여 형질전환체를 확보하고 이들의 표현형 및 유전형을 분석하였다. 마지막으로, T-DNA 삽입 형질전환체와 T-DNA activation-tagging 형질전환체 군에서 공유 유전자를 확보하여 이들 공유유전자의 유전형 분석 및 표현형을 비교 분석하여 유전자 기능을 밝히는 것을 연구 목표로 설정하였다.

연구결과
우리는 기존에 생성된 ATMT mutant library로부터 삽입위치가 밝혀지지 않은 다수의 형질전환체를 regeneration하여 삽입 위치를 밝혀 유전자 기능연구를 위한 다수의 정보를 확보하였다. 또한 이 정보를 확보하기 위해 기존에 개발된 TAP 시스템을 활용하였으며, 이 과정에서 TAP 시스템을 좀더 손쉽게 활용 할 수 있는 시스템으로 정비하였다. 방향성을 갖는 constitutive expression promoter인 β-tubulin 유전자의 promoter영역을 활용하여 벼 도열병 곰팡이를 위한 activation tagging system을 개발하였다. 개발된 시스템을 활용하여 총 4,432개의 형질전환체를 생산하였다. 총 21,070개의 ATMT mutant들 중 2,221개의 ATMT mutant들로부터 TTL을 확인하였으며, ATL mutant 4,432개의 mutant로부터 2,651개 ATL mutant로부터 TTL을 확인하였다. 그 결과, ATMT는 1,512개의 TTL을 ATL의 경우는 1,886개의 TTL로 밝혀졌다. 동일 locus에 T-DNA가 삽입된 중복되는 mutant는 모두 제거되었다. TTL이 확인된 mutant들을 대상으로 중복되는 locus를 살펴본 결과 194개의 loci가 ATMT와 ATL mutant를 모두 갖는 것으로 나타났다. 194개의 shared loci중 ATMT와 ATL mutant에서 해당 유전자의 transcript가 야생형에 대비하여 각각 down-regulated되거나 up-regulated되는 경우를 살펴본 결과 총 83개의 loci에 해당하는 ATMT와 ATL mutant가 선별되었다. 이 83개의 loci중 ATMT 혹은 ATL mutant에서 병원성 관련 표현형이 야생형에 대비 통계학적으로 유의한 수준으로 다르게 나타나는 경우인 72개의 loci가 선별되었다. 포자형성에서 가장 많은 수의 mutant가 야생형에 비해 포자형성이 줄거나 늘어났으며, 그 다음으로 병원성이 상실되거나 늘어나는 것으로 나타났다. 우리는 앞선 194개의 loci 모두에 해당하는 ATMT와 ATL mutant 모두를 대상으로 high-throughput mutant screening 방법을 적용하여 표현형을 모두 검정하였다. 선별된 194개 loci 들의 대부분이 hypothetical protein으로 예측되었을 뿐만 아니라, 각 유전자간의 상관관계를 조사해보기 위해 KEGG database를 적용하여 194개 유전자의 위치도를 확인하여 이들간의 상관관계 조사를 위한 map을 완성하였다.

연구결과의 활용계획
이 연구는 기존의 개발된 연구기법을 한층 더 up-grade한 activation tagging system으로 지금까지 밝히지 못했던 치사 및 중복유전자들을 포함하는 대량 유전자 기능분석을 system wide하게 개발한 최초의 방법으로서 아직까지 연구되지 않은 다른 곰팡이 유기체에도 적용할 수 있는 매우 효율적인 방법이다. 따라서 이번 연구에서 개발된 high-throughput 연구기법을 도입하여 다른 곰팡이 유기체서의 기능유전체학을 위한 기반 연구로서 활용 될 수 있을 것이며, 치사 혹은 중복 유전자를 포함하는 기능유전체학 연구에 role model로 제실 될 것이다.

Abstract ▼

Purpose& contents
The aim of this research is to understand the pathogenicity factors of the rice blast fungus at the systems level via genome-wide screening for pathogenicity genes and in-depth characterization of their functions. Primarily, we performed to identify TTL region from ATMT mutants

Purpose& contents
The aim of this research is to understand the pathogenicity factors of the rice blast fungus at the systems level via genome-wide screening for pathogenicity genes and in-depth characterization of their functions. Primarily, we performed to identify TTL region from ATMT mutants which showed reduced pathogenicity. Secondary, we constructed vector for activation-tagging for M. oryzae and then produced large number of activation-tagging lines (ATL). Finally, we selected shared loci from ATMT and ATL mutants through bioinformatic tools, named TAP. The selected shared loci were identified by phenotype analysis.

Result
Previously, 21,070 transformants were generated via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT). We performed thermal assymetric interlaced (TAIL)-PCR and Southern blot analysis and confirmed more than 15,000 TTL from the ATMT mutant library through TAP system that is automatically analyzed TTL location. We also developed a novel platform for functional analysis genes in Magnaporthe oryzae by constitutive expression under a strong promoter. Employing a binary vector (pGOF1), carrying EF1α promoter, we generated a total of 4,432 activation-tagging transformants (ATL) by Agrobacterium tumafaciens-mediated transformation. We also performed TAIL-PCR and Southern blot analysis using 2,651 ATL. We have analyzed a subset of 54 transformants that have the vector inserted in the promoter region of individual genes, at distances ranging from 44 to 1,479 bp. These transformants showed increased transcript levels of the genes that are found immediately adjacent to the vector, compared to those of wild type. Ten transformants showed higher levels of expression relative to the wild type not only in mycelial stage but also during infection-related development. A total 194 shared loci were found between ATMT and ATL mutants. Among those, we found that 83 loci showed up-regulated transcript in ATL mutant and down-regulated down-regulated ATMT mutants compared to that of wild-type. Based on results from pathogenicity-related phenotype analysis, ATMT or ATL mutants corresponding to 72 loci showed statistically differences compared to that of wild-type. We found that a large number of mutants showed defect in conidiation and pathogenicity. We also performed gene’s map by KEGG database.

Expected Contribution
Our data demonstrated that comparative phenotypic analysis under over-expression and suppression of gene expression could prove a highly efficient system for functional analysis of the genes. Our over-expressed transformant library would be a valuable resource for functional characterization of the redundant or lethal genes in M. oryzae and this system may be applicable in other fungi.