보고서 정보
주관연구기관 |
건국대학교 KonKuk University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2014-05 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning |
과제관리전문기관 |
한국연구재단 National Research Foundation of Korea |
등록번호 |
TRKO201500004088 |
과제고유번호 |
1711003501 |
사업명 |
중견연구자지원 |
DB 구축일자 |
2015-05-23
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키워드 |
시토크롬 P450.방선균.항생물질.효소.대사.X-ray 결정.구조 기능 연관성.돌연변이.분자진화기술.cytochrome P450.actinobacteria.antibiotics.enzyme.metabolism.X-ray crystal.structure function relationships.mutagenesis.directed evolution.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500004088 |
초록
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연구의 목적 및 내용
본 연구의 목표는 주요 항생물질들을 생성하는 방선균들의 전체 유전체 서열 정보를 이용하여 방선균주내에 존재하는 다양한 시토크롬 P450 유전자들의 라이브러리 (CYPome)를 구축하고, 이들의 단백질 분자 구조 규명, 효소 활성 연구 및 돌연변이 생성을 통하여 방선균 시토크롬 P450 효소들의 세포내 생리적 역할을 규명하여 이를 바탕으로 새로운 감염성 질환의 신약 후보 물질 개발에 응용하는 것임.
연구결과
[1차년도 연구결과]: 방선균들의 전체 유전체 정보를 이용한 CYPome 구축 및 효소 발
연구의 목적 및 내용
본 연구의 목표는 주요 항생물질들을 생성하는 방선균들의 전체 유전체 서열 정보를 이용하여 방선균주내에 존재하는 다양한 시토크롬 P450 유전자들의 라이브러리 (CYPome)를 구축하고, 이들의 단백질 분자 구조 규명, 효소 활성 연구 및 돌연변이 생성을 통하여 방선균 시토크롬 P450 효소들의 세포내 생리적 역할을 규명하여 이를 바탕으로 새로운 감염성 질환의 신약 후보 물질 개발에 응용하는 것임.
연구결과
[1차년도 연구결과]: 방선균들의 전체 유전체 정보를 이용한 CYPome 구축 및 효소 발현
- 주요 방선균들 (S. coelicolor, S. avermitilis, S. peucetius, S. erythraea)의 전체 유전체 정보수집
- 방성균 genomic DNA를 얻은 후 시토크롬 P450 유전자 클로닝을 통한 CYPome 라이브러리 구축함
- 방선균들의 시토크롬 P450을 대장균에서 발현하여 P450 특이적 스펙트럼 및 효소 구조활성 분석함
- 방선균 P450 유전자의 대장균내 발현 벡터개발 및 대량 발현 조건 확립
(CYP105N1, CYP107W1, CYP107L2, CYP158A3,CYP107F2, CYP107V1, CYP107X1, CYP105R1)
[2차년도 연구결과]: 방선균들의 시토크롬 P450들의 특이적 효소 화학 반응 규명 연구 진행
- 방선균 시토크롬 P450의 효소 화학 반응 및 기질 특이성 규명 연구
- 시토크롬 P450의 활성 재현을 위한 전자전달시스템 규명 연구
- Steady-state 상태에서 각 효소별 효소-촉매효율 분석(CYP105N1, CYP107W1, CYP107L2, CYP158A3, CYP107F2)
[3차년도 연구결과]: 방선균들의 시토크롬 P450 분자 구조 분석 연구 및 효소 활성 규명
- 방선균 시토크롬 P450 단백질 대량 분리정제 기술 확립함
- 순수 분리된 단백질 대량 정제 및 X-ray 결정 구조 분석 (CYP105N1, CYP107W1, CYP107L2)
- Site-directed mutagenesis 및 directed evolution 방법을 이용한 돌연변이 단백질 확보 및 화학 반응, 기질 특이성 연구 (HPLC, LC, MS)
연구결과의 활용계획
- 방선균에 의한 항생물질 생합성 과정에 대한 분자적 수준의 이해
- 국제 저명학술지에 연구성과 발표 (기 4편 발표, 추후 다수 발표 예정)
- 항생물질 생성 방선균 P450 효소에 관한 연구 수준의 국제화
- 새로운 감염증 치료 물질 개발의 이론 제공 및 응용
- 우수핵심연구인력 (대학원생 박사과정 3명, 석사졸업 3명)의 양성
Abstract
▼
Purpose&contents
The purpose of the research is to analyze the structures, functions, and activities of the total actinobacterial P450 enzymes library (CYPome) for the elucidation of their roles in the cells and to engineer the antiobiotics-producing P450 enzymes for the development of new drug c
Purpose&contents
The purpose of the research is to analyze the structures, functions, and activities of the total actinobacterial P450 enzymes library (CYPome) for the elucidation of their roles in the cells and to engineer the antiobiotics-producing P450 enzymes for the development of new drug candidates.
Result
[The 1st year research results]: To construct the CYPome using the total genomic information of actinobacteria and to express the P450 enzymes
- Collection and Analysis of the genomic information of main actinobacteria (S.coelicolor, S. avermitilis, S. peucetius, S. erythraea)
- Expression of the total actinobacteria P450 enzymes and Measurement of the CO-Fe2+ spectra and enzyme activities
- Development of the P450 expression vectors in E. coli and Optimization of the expression condition
(CYP105N1, CYP107W1, CYP107L2, CYP158A3,CYP107F2, CYP107V1, CYP107X1, CYP105R1)
[The 2nd year research results]]: To elucidate the specific enzyme chemistry from actinobacteria P450s
- Analysis of the enzymatic reaction of actinobacteria P450s and Identification of the specific substrates
- Construction of the reconstitution system of P450 and Identification of the specific reduction partners for the enzyme activity
- Analysis of catalytic efficiencies of P450 enzymes in steady-state status (CYP105N1, CYP107W1, CYP107L2, CYP158A3, CYP107F2)
[The 3rd year research results]: To study the structures and activities of actinobacteria P450 enzymes
- Establishment of purification of actinobacterial P450 enzymes in large scale
- Analysis of X-ray crystal structures of the purified P450 enzymes (CYP105N1, CYP107W1, CYP107L2)
- Construction of actinobacteria P450 mutant enzymes using site-directed mutagenesis and directed evolution (HPLC, LC, MS)
Expected Contribution
■ To understand the biosynthetic mechanism of antibiotics in the molecular level
■ To educate the well trained researchers (Ph.D. candidates 3, MS 3 students)
■ To publish in the highly reputed international journals (4 published, expected more)
■ To achieve the global leading research on actinobacterial cytochrome P450 enzymes
■ To propose the new drug candidates and collaboration with pharmaceutical industry
목차 Contents
- 핵심연구사업 최종보고서(평가용) ... 1
- 목 차 ... 3
- 연구계획 요약문 ... 4
- 연구결과 요약문 ... 5
- 한글요약문 ... 5
- SUMMARY ... 6
- 연구내용 및 결과 ... 7
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 9
- 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 15
- 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 49
- 5. 연구결과의 활용계획 ... 50
- 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 50
- 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 52
- 8. 참고문헌 ... 53
- 9. 연구성과 ... 55
- 10. 기타사항 ... 55
- 끝페이지 ... 67
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