초록 ▼

연구의 목적 및 내용
본 연구에서는 현재까지 생리학/약리학적인 접근법을 이용하여 약물이나 patch clamp기법으로만 그 존재가 알려져 왔던 미토콘드리아막 발현 이온통로에 대하여 실제 분자적인 구조를 밝혀내고 그 기능적인 연구를 통하여 세포보호 기전에 관여하는 미토콘드리아막 이온통로의 세포내 신호전달기전을 규명하는데 그 목표를 둠
유전자 발굴의 1차적 핵심 사항은, 이미 알려진 유전자 전체 정보 중에서 원하는 목적 유전자의 전장을 파악하고 그것의 유전자적 실체를 밝히는 분자생물학적/생체기능학적 특징화의 과정. 본 연구에

연구의 목적 및 내용
본 연구에서는 현재까지 생리학/약리학적인 접근법을 이용하여 약물이나 patch clamp기법으로만 그 존재가 알려져 왔던 미토콘드리아막 발현 이온통로에 대하여 실제 분자적인 구조를 밝혀내고 그 기능적인 연구를 통하여 세포보호 기전에 관여하는 미토콘드리아막 이온통로의 세포내 신호전달기전을 규명하는데 그 목표를 둠
유전자 발굴의 1차적 핵심 사항은, 이미 알려진 유전자 전체 정보 중에서 원하는 목적 유전자의 전장을 파악하고 그것의 유전자적 실체를 밝히는 분자생물학적/생체기능학적 특징화의 과정. 본 연구에서는 1) 목적으로 하는 이온채널이 미토콘드리아에서 발현하는 지를 확인 할 수 있는 생리학적/약리학적 기법을 이용하여 유전자 발현을 간접적으로 증명하고, 2) 유전자 정보의 바다에서 원하는 이온채널 유전자와 특징을 같이하는 채널유전자들을 모두 검색하고 집단화하여 이들 사이에 존재하는 상동성이 높은 뉴클레오티드 염기 서열/아미노산 서열을 확인하고 이 구역을 중심으로 프라이머를 설계하며, 3) 유전자의 전장을 클로닝하기 위해 상기의 프라이머와 아울러 RACE PCR기법을 이용하여 ORF을 포함한 up & down stream의 염기서열을 빠짐없이 모두 확인하여 전장의 유전자 정보를 얻어냄. 또한, 4) 유전적 정보가 확인된 목적 이온채널을 형광단백 발현 벡터에 연결하여 재조합 DNA를 제작하여 이 구조물을 세포내로 유전자도입 하여 미토콘드리아 막에서의 발현 및 기능적인 활성 유무를 관찰 하는 것 등의 목적을 달성. 1)에서 4)까지의 단계를 거쳐 1차적으로 미토콘드리아 발현 이온통로임을 밝혀내고, 향후 2차적으로는 이들의 유전자적 특징을 이용하여 미토콘드리아로 이주하는 신호체계를 밝혀 임상적인 활용에 도모하고 컴퓨터 시뮬레이션을 통한 심장보호기전을 데이터화/예측할 수 있는 시스템 (예, 피지옴) 구축에도 적극 활용하려는 목적으로 본 연구를 수행
연구결과
1. 후보유전자 클로닝 및 characterization
● 심근세포의 원형질막에서는 발현되지 않으나 생리/약리학적 기법을 통해 미토콘드리아 막에서의 발현이 예상되고 있는 BKCa 통로의 경우, 심근세포의 순수분리를 통해 얻어 낸 핵내 유전정보의 cDNA library로부터 미토콘드리아 BKCa 통로를 코딩하는 것으로 추정되는 후보유전자의 부분 염기서열을 찾아내어 ORF를 포함한 전장 염기서열을 밝힘
● KATP 통로의 염기서열분석 결과, 일부 염기서열(32 bp)의 결손형과 점돌연변이형(V->M)이 관찰됨
● 심근에서 발현이 인정되는 KATP 통로는 이제까지 보고되었던 염기서열과는 다른 아형들이 존재하고 있었으며, BKCa 통로의 경우 심근세포에서 처음으로 클로닝되는 등 향후 기능적인 검사결과에 따라 미토콘드리아 이온통로를 코딩하는 후보유전자의 발굴이 기대됨
● BKCa 통로의 경우 심근과 뇌조직에서의 mRNA 발현양상을 확인한 결과, 본 실험에서 발굴된 후보유전자 이외의 BKCa 통로는 심근세포에서는 발현되지 않음. 이러한 결과와 더불어 심근에는 BKCa 통로가 발현되지 않는다는 지금까지의 보고 등을 통하여 본 연구에서 클로닝된 BKCa 통로는 미토콘드리아막에서 발현되는 mitoBKCa 통로일 가능성이 제기됨
● IPC 조건에서 mitoBKCa 통로가 세포보호기전에 관여한다는 보고를 근거로 IPC를 실시한 심장의 심근세포에서 본 연구에서 클로닝된 BKCa 통로 mRNA의 발현을 real time PCR을 통하여 확인한 결과, IPC 심근세포에서 심근 BKCa 통로가 control에 비해 과발현되어 있음을 확인
2. 후보유전자의 미토콘드리아막내 발현 확인
● 분리된 심근세포에서 미토콘드리아 BKCa 통로의 미토콘드리아막내 발현을 확인하기 위하여 mitotracker green과 BKCa 통로 검출용 형광항체(red계열)를 이용하여 confocal microscopy 상에서 관찰한 결과, 미토콘드리아와 본 연구를 통하여 밝혀진 BKCa 통로의 겹침 현상(merge)을 확인
● 분리된 미토콘드리아에서 단백을 추출하고 여기에 BKCa 통로 항체를 이용하여 단백 발현을 확인하였으며, 미토콘드리아막에 발현되는 것을 형광항체를 이용한 이미징법을 통해서도 확인
연구결과의 활용계획
● 본 연구를 통해 확인된 여러 아형과 기존 보고된 원형질막 발현 이온통로와의 분자구조적 차이를 밝힘
● 미토콘드리아 막으로 이동하는 이온통로들의 특이적 전이신호를 규명을 위한 중요한 자료로 활용
● 국가 경쟁력 강화차원에서 미토콘드리아 관련 의생명과학 분야의 핵심기술을 연마한 인력양성에 활용

Abstract ▼

Purpose&contents
The mitoKATP and mitoBKCa channel have been demonstrated to be the key cytoprotective mitochondria ion channels. However, because the molecular identification of the mitochondria ion channels is unknown, the mechanism of cytoprotection related to mitochondria and signal pathway a

Purpose&contents
The mitoKATP and mitoBKCa channel have been demonstrated to be the key cytoprotective mitochondria ion channels. However, because the molecular identification of the mitochondria ion channels is unknown, the mechanism of cytoprotection related to mitochondria and signal pathway are not yet clear. In this study, we are aiming at the mitochondria ion channel gene discovery.
1. Mitochondria BKCa gene discovery
2. Mitochondria KATP gene discovery
3. Characterization of mitochondria ion channel
4. Function analysis of target ion channel by using transfected cell line
5. Application of above to further –omic study
Result
1. Cloning and characterization of target gene
● BKCa channel was successfully cloned for the first time and the ORF sequences of BKCa were analyzed by using cDNA library from cardiac myocytes
● In the results of KATP sequence analysis, some variants of deletion (32 bp) and point mutation(V->M) were detected
● mRNA expression pattern of mitoBKCa in mouse cardiomyocytes was confirmed the using gene-specific primers from the region where insertion/deletion sites differ between Kcnma1 and mitoBKCa. RT-PCR results showed that Kcnma1 transcripts were highly expressed in mouse brain but not in cardiomyocytes.
● These results indicated that the unique BKCa channel alph-subunit in cardiomyocytes was mitoBKCa
● In real-time PCR experiments, BKCa mRNA expression was up-regulated by ischemic preconditioning, and mitoBKCa channels have been considered key effectors in cardioprotection
● Several isoforms of BKCa channel alpha-subunit, alternatively spliced in the N- and C-terminus, have been cloned from a number of mammalian species, yet no isoforms corresponding to BKCa channel alpha-subunit have been isolated from hearts
2. Expression of mitoBKCa in mitochondria membrane
● To identify the expression and localization of mitoBKCa, mitochondria was isolated from H9c2 and loaded with MitoTracker, fixed, permeabilized and labeled with anti-BKCa Ab
● Purified mitochondria from H9c2 was double-labeled with anti-BKCa pAb and MitoTracker
● Mitochondria proteins were used in western blot and mitoBKCa expression was confirmed
Expected Contribution
● Molecular Identification of mitochondria ion channels
● Clarification of the mitochondria ion channel-specific translocation signal into mitochondria
● Building up the specialists in biomedical field of mitochondria-related cardiovascular disease and cell death

목차 Contents

• 핵심연구사업 최종보고서(평가용) ... 1
• 목 차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 9
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 13
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 25
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 29
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 31
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 32
• 8. 참고문헌 ... 33
• 9. 연구성과 ... 35
• 10. 기타사항 ... 37
• 끝페이지 ... 53