보고서 정보
주관연구기관 |
건국대학교 KonKuk University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2014-05 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning |
등록번호 |
TRKO201500004430 |
과제고유번호 |
9991002808 |
사업명 |
일반연구자지원(교육부) |
DB 구축일자 |
2015-05-30
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500004430 |
초록
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(개요) 본 과제는 혈관수축/이완기능에 있어서의 항산화 단백질 DJ-1의 역할을 규명하기위하여 ① DJ-1결핍 시의 혈관 수축·이완 기능변화의 비교 분석 및 DJ-1 결핍(KO) 혈관 내피세포에서의 DJ-1과 관련된 가능 단백질을 관찰하고, ② 관련 기능단백질과 DJ-1의 상관관계 및 일련의 연구를 통한 혈관 수축/이완에 있어서의 항산화 단백질 DJ-1의 역할 등을 검토하였음. (방법 및 결과) 1) 분리배양된 내피세포 및 혈관조직은 DJ-1KO와 WT군사이에서 형태학적 차이를 나타내지 않음. 2) DJ-1KO의 혈관평활근/내피세포
(개요) 본 과제는 혈관수축/이완기능에 있어서의 항산화 단백질 DJ-1의 역할을 규명하기위하여 ① DJ-1결핍 시의 혈관 수축·이완 기능변화의 비교 분석 및 DJ-1 결핍(KO) 혈관 내피세포에서의 DJ-1과 관련된 가능 단백질을 관찰하고, ② 관련 기능단백질과 DJ-1의 상관관계 및 일련의 연구를 통한 혈관 수축/이완에 있어서의 항산화 단백질 DJ-1의 역할 등을 검토하였음. (방법 및 결과) 1) 분리배양된 내피세포 및 혈관조직은 DJ-1KO와 WT군사이에서 형태학적 차이를 나타내지 않음. 2) DJ-1KO의 혈관평활근/내피세포의 기능적 특징: ① DJ-1KO마우스군은 WT군에 비해 대동맥 및 저항성혈관(장간막동맥)등에서의 norepinephrine(NE)에 의한 내피의존성 수축의 증가 및 약화된 acetylcholine (Ach) 반응성를 보임. ROS 억제제 처리는 DJ-1KO혈관의 NE에 의한 내피의존성 수축을 증가시켰으나 WT마우스군에서는 변화가 없었음. ② DJ-1 마우스의 대동맥 및 장간막동맥 조직 및 분리된 혈관내피세포는 정상마우스군에 비해 약한NO 발현을 보였음. ③ 혈관 조직 및 분리된 내피세포에서의 eNOS 발현은 DJ-1 KO 마우스가 WT군보다 감소하였음. 분리된 내피에서 또한 eNOS의 mRNA 및 단백질의 발현 정도가 모두 WT내피세포에 비해DJ-1 KO군에서 감소했음. 한편, DJ-1을 인위적으로 과발현 시킨 DJ-1KO혈관내피세포는 증가된 nitric oxide (NO) 발현 및 eNOS의 발현을 나타냄. ④ 혈관조직과 분리배양된 혈관세포에서의 ROS의 발생 정도는 DJ-1KO군이 정상군보다 뚜렷한 증가를 나타냄. 3) 혈관내피 세포에서의 단백체 변화: Proteomics법을 이용한 분석에서, DJ-1KO혈관내피세포군은 WT세포군에 비해 5개의 spot발현차이를 보였으며, 이중 3개의 단백질이 동정됨. 또한 H2O2처리후 비교에서 DJ-1KO세포군은 WT세포군에 비해 8개spot 발현차이를 보였으며, 이중 3개의 감소된 단백질 및 1개의 증가된 단백질이 동정됨.
한편 DJ-1KO세포군의 H2O2처리군과 비처리군의 비교에서 7개의 spot 발현차가 관찰되었으며, 이중 2개의 감소된 단백질 및 4개의 증가된 단백질이 동정됨. 동정된 단백질 대부분은 세포골격, 단백분해관련, 촉매관련, 항산화관련 단백질이었음. 4) 활성산소종(ROS)처리된 혈관내피세포에서의 eNOS 관련 단백변화: H2O2처리에 의한 내피세포에서의 eNOS 발현의 정도는 낮은 농도처리에서 약간증가경향이, 고농도처리에서는 eNOS의 발현감소 및 eNOS promotor에서 Histone deacetylase-1(HDAC1) recruitment의 증가가 관찰됨. 6) 혈관내피 유래Target 단백의 혈관장력변화와의 상호 관련성: Muscarinic ACh receptor(mAchR)와 관련가능성이 보고되고 있는 α-actinin 4는 혈관조직(en face) 및 내피세포에서의 mAchR와 colocalization이 확인되었으며, α-actinin 4의 전처리는 내피의존성 혈관이완을 억제하였음. NO발생에 중요한 factor인 GTPCH1,dihydropteridine reductase (DHPR), BH4, BH2의 혈관세포에서의 mRNA수준 및 농도분석에서 BH2 및 BH4의 세포내 수준과 총 biopterin 대한 BH2비가 WT에 비해 DJ-1KO 세포에서 증가가 관찰됨. 혈관내피세포에서 eNOS의 promotor상의 HDAC1 recruitment가 정상군보다 DJ-1KO군에서 증가하였으며, H3 histone acetylation은 DJ-1KO 군이 정상군보다 감소하였음. 한편, DJ-1KO의 혈관평활근세포에서 Peroxiredoxin 2, Catatase, Superoxide dismutase1은 감소하는 경향을, Superoxide dismutase 2는 증가하는 경향을 나타내었음. 7) 항산화 단백 DJ-1KO마우의 혈관수축/이완변화와 관련 target 인자의 혈압관련성 검토: NOS억제제 및 ROS 억제제의 처리는 손상된 DJ-1KO혈관의 내피의존성 이완을 억제함.
또한 고혈압 상의 DJ-1KO 마우스로부터 분리한 혈관조직(en face)에서 eNOS/NO발생 정도가 감소하고 HDAC1 recruiment가 증가되는 경향을 나타냄. HDAC1억제제를 투여한 정상마우스군에서 혈관장력의 변화가 관찰됨. 8) DJ-1과 관련된 수축 및 이완기전 및 고혈압변화 관련 인자의 검토: HDAC1을 인위적 감소시킨 세포에서의 eNOS의 발현 감소를 확인하였으며, HDAC1 억제제를 처리한 DJ-1KO 마우스의 혈관조직에서 NO발생, eNOS발현/H3 acetylation의 증가가 관찰됨. 또한 DJ-1KO 마우스에 HDAC1 억제제처리는 증가되었던 혈압의 감소 유발 시킴. 9) DJ-1KO 동물 혈관내피세포에서의 혈관장력반응성관련 반응들의 인간 혈관내피세포에의 응용 검토. 인간혈관내피세포 HUVEC에 인위적으로 DJ-1을 감소시키면,DJ-1KO마우스에서처럼 eNOS/NO발현의 감소 및 HDAC1 recruiment의 증가가 확인됨. HDAC1을 인위적으로 감소시킨 HUVEC은 eNOS의 발현감소를 나타냄. 또한 H2O2를 처리한 HUVEC은 eNOS발현감소,HDAC1 recruiment증가 및 H3acetylation의 감소가 관찰됨. (결론) 본 연구결과는 H2O2에 의해 매개되는 eNOS의 epigenetic억제에 의한 NO감소에 DJ-1단백이 관여하여 혈관수축성 및 혈압조절에 공헌할 가능성을 제시함. 따라서 본 과제의 연구결과들은 산화스트레스 관련된 혈관 질환 연구 분야 및 혈관질환의 예방/진단/치료를 위한 분야에 새로운 정보를 제공할 것으로 사료됨.
Abstract
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This research was designed to uncover the role of DJ-1 in vascular smooth muscle contraction and relaxation using DJ-1 knockout (KO) mice. For this purpose, we also identified target proteins from vascular cells using proteomics-based analysis and focused on discovering relationship between DJ-1 and
This research was designed to uncover the role of DJ-1 in vascular smooth muscle contraction and relaxation using DJ-1 knockout (KO) mice. For this purpose, we also identified target proteins from vascular cells using proteomics-based analysis and focused on discovering relationship between DJ-1 and target proteins in vascular contraction and relaxation, as well as blood pressure. Vascular endothelial cells (ECs) and en face tissues did not show any morphological differences between DJ-1KO and wild type(WT) control group. Norepinephrine (NE)-induced contraction was greater in endothelium-intact aortas and mesenteric arteries of DJ-1KO than those of WT control. Acetylcholine(ACh) inhibited NE-evoked contraction in endothelium-intact aortas and mesenteric arteries, and these were attenuated in DJ-1KO mice compared with WT control.
Nitric oxide (NO) production and endothelial NO synthase (eNOS) expression were lower, but H2O2 production was higher, in ECs from DJ-1KO mice than in those from WT controls and these effects were reversed by DJ-1-overexpressing ECs from DJ-1KO mice. ROS inhibition and NOS inhibition recovered the impaired endothelium-dependent vasorelaxation in DJ-1KO group. Histone deacetylase-1 (HDAC-1) recruitment and H3 histone acetylation at eNOS promoter were elevated and diminished, respectively, in DJ-1KO compared with WT controls. Treatment with H2O2 decreased eNOS expression and increased HDAC-1 recruitment at eNOS promotor and in control ECs, HDAC1 knockdown induced eNOS expression enhancement. In proteomics assay, 5 proteins were differentially expressed in comparison between DJ-1KO and WT cotrol ECs. Of them, 3 proteins was are identified.
In H2O2-exposed ECs, 8 proteins were altered in comparison between DJ-1KO and WT control.Of them, 4 proteins were identified. Differentially expressed proteins was 7 proteins between H2O2-untreated and treated ECs of DJ-1KO group and 6 protein among them were identified.These identified proteins were found as proteins relative to cytoskeletal structure, protein lysis,and catalytic action, antioxidative action. In addition, α-actinin 4, which is known to be able to be linked to muscarinic ACh receptor(mAchR), was colocalized with mAchR on endothelial cells and α-actinin 4 antibody treatment inhibited endothelium-dependent vasorelaxation. The intracellular levels of BH2 and BH4 and the ratio of BH2 to total biopterin were increased in DJ-1KO compared with WT control cells.
DJ-1KO vascular smooth muscle cells showed the decreased levels of peroxiredoxin 2, catalase, and superoxide dismutase1 compared with WT control. Moreover, systolic blood pressure(SBP) was elevated in DJ-1KO mice compared with WT controls, but this elevation was suppressed in DJ-1KO mice treated with valproic acid, an inhibitor of class I HDACs including HDAC-1. In test using human umbilical vein ECS.(HUVECs), the eNOS-associated epigenetic characteristics and several responses in mouse ECs.showed simialr tendency, implying that our results in mouse ECs may be applied to human ECs.
This project results indicate that DJ-1 protein may be associated with the regulation of vascular contractility and blood pressure, probably via decrease of NO production by H2O2-mediated epigenetic inhibition of eNOS expression. Therefore, this project will provide useful information for the development of a potential target for therapeutic strategies and mechanism research for prevention/treatment/care of vascular disorders linked to oxidative stress.
목차 Contents
- 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
- 목차 ... 3
- Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
- Ⅰ. 연구결과 요약문(영문) ... 5
- Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 6
- 1. 연구과제의 개요 ... 6
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 6
- 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 6
- 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 8
- 5. 연구결과의 활용 계획 ... 9
- 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 ... 9
- Ⅲ. 연구성과 ... 10
- 끝페이지 ... 11
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