초록 ▼

Ⅳ 연구결과
기능성물질 2종 (기능성황화합물, 폴리페놀) 및 위해물질 2종(우르시올, 신·변종미생물)의 신속동시분석기술을 다음과 같이 확립하였다.
ㅇ 마늘 생리활성 지표물질 중 함황화합물 신속분석법 확립
- Macerated garlic oil: Macerated garlic oil에서의 기능성 황화합물 6종을 분리·분석하기 위해 40% ethyl acetate in hexane으로 추출하여 Sil analytical (5 um, 250㎜ × 4.6 ㎜)컬럼과 HPLC/PDA 시스템을 이용하여 E,Z-ajoen

Ⅳ 연구결과
기능성물질 2종 (기능성황화합물, 폴리페놀) 및 위해물질 2종(우르시올, 신·변종미생물)의 신속동시분석기술을 다음과 같이 확립하였다.
ㅇ 마늘 생리활성 지표물질 중 함황화합물 신속분석법 확립
- Macerated garlic oil: Macerated garlic oil에서의 기능성 황화합물 6종을 분리·분석하기 위해 40% ethyl acetate in hexane으로 추출하여 Sil analytical (5 um, 250㎜ × 4.6 ㎜)컬럼과 HPLC/PDA 시스템을 이용하여 E,Z-ajoene등 6종을 동시에 분리하였고 유효성 검증도 매우 만족할만한 결과였음. 또한 Ajoene 안정성 평가 결과 E-ajoene은 4℃ 및 10℃ 매우 안정한 화합물임을 확인하였음.
- Allicin 분해산물 : Pure한 garlic oil의 생리활성물질 8종을 분리·분석하기 위해 steam distillation 장치를 이용하여 garlic oil을 제조한 다음, 70% acetonitrile 50㎖를 가하여 1분간 voltex로 혼합한 후 0.45 um membrane filter로 여과하여 HPLC에 주입한 결과 검량선의 직선
성, LOD 및 LOQ, 반복성, 재현성 및 회수율을 산출하여 분석법의 유효성을 검증한 결과 모두 국제적 기준에 적합한 것으로 나타냄. 또한 allicin 안정성 평가 결과 4℃ 및 -1℃ 안정한 화합물임을 확인하였음.
- 마늘의 미량기능성 성분 : 마늘의 미량기능성 성분인 methiin 및 cycloalliin을 분석하기 위해 D.W로 추출하여 NH2P-50 4E (5 um, 250㎜ × 4.6 ㎜)컬럼과 HPLC/PDA 시스템을 이용하여 미량 기능성황화합물 2종을 동시에 분리하였으며, 이때의 유효성 검증은 국제적 기준
에 적합한 것으로 나타남. 또한 Cycloalliin 생성 영향인자 및 최대 생성조건을 검토한 결과 cycloalliin이 가장 많이 생성되는 저장마늘을 이용하여 cycloalliin 최대 생성 조건을 탐색하였 으며 이를 위하여 반응표면분석법(Response Surface Methodology)을 사용하였으며 실험 계
획은 중심합성계획 (Central Composite of Design: CCD)을 이용하였음. 2013년 생산 저장마늘을 이용하여 실험한 결과 cycloalliin 생성에 적합한 최적반응조건으로 제조할 경우 21.3mg/g, dry base cycloalliin을 생산할 수 있는 것으로 나타났음.
ㅇ 마늘 가공품의 체내 대사체 분석법 확립.
- SAC 표준품 및 SAC 증대 가공품의 섭취 시 혈장을 제단백하여 LC-MS/MS 크로마토그램으로 분석한 결과, 내부 간섭물질의 방해 없이 SAC 및 그 대사체를 분리함. 분석법을 검증한 결과, 검량선의 직선성, LOD, LOQ, 반복성, 재현성 및 회수율에 대한 유효성검증을 실시한
결과 모두 국제적 수준에 적합한 것으로 나타냄. In vivo로 SAC 표준품을 단회경구투여 [1(시료 A), 12.5(시료 B) 및 25 (시료 C) mg/kg]한 결과, 시료 A의 AUC0-6은 1.2 ug/ml · hr, 시료 B는 17.6 ug/ml · hr, 시료 C는 34.2 ug/ml · hr이었으며, T_max (hr)는 시료 A, 시료 B 및 시료 C 모두 0.5 min으로 비슷하였음. C_max는 시료 A는 0.5 ug/ml, 시료 B는 10.5 ug/ml, 시료 C는 15.2 ug/ml이었음. 흰쥐에 SAC 증대 가공품을 SAC 1 mg/kg의 농도로 경구투여 시 AUC_0-6은 2.2 ug/ml · hr, C_max는 0.9 ug/ml, T_max (hr)는 1 hr이었음.
- Allicin 분해산물인 DADS 표준품 및 마늘 오일의 섭취 시 혈장을 LLE로 전처리하여 GC/MS 크로마토그램으로 분석한 결과, 내부 간섭물질의 방해 없이 DADS 및 그 대사체를 분리함. 분석법을 검증한 결과, 검량선의 직선성, LOD, LOQ, 반복성, 재현성 및 회수율에 대한
유효성검증을 실시한 결과 모두 국제적 수준에 적합한 것으로 나타냄. In vivo로 흰쥐에 DADS 을 단회경구투여 [20(시료 A)및 50(시료 B) mg/kg]한 결과, T_max은 시료 A 및 시료 B 모두 1 hr으로 비슷하였으며, C_max는 시료 A는 69.6 ng/mL, 시료 B는 70.4 ng/mL를 나타냄. 흰쥐에 마늘 오일을 DADS 20 mg/kg의 농도로 경구투여 시 AUC0-6은 2.2 ug/ml · hr, T_max는 0.9 ug/ml, Tmax (hr)는 1 hr이었음.
- Cycloalliin 표준품 및 cycloalliin 증대 가공품의 섭취 시 혈장을 제단백하여 LC-MS/MS 크로마토그램으로 분석한 결과, 내부 간섭물질의 방해 없이 cycloalliin 및 내부표준물질인 deoxycycloalliin을 분리함. 분석법을 검증한 결과, 검량선의 직선성, LOD, LOQ, 반복성, 재현
성 및 회수율에 대한 유효성검증을 실시한 결과 모두 국제적 수준에 적합한 것으로 나타냄. In vivo로 흰쥐에 cycloalliin을 단회경구투여 [25(시료 A) 및 50 (시료 B) mg/kg]한 결과는 시료 A의 AUC0-24은 2841.4 ng/ml · hr, 시료 B는 7097.8 ng/ml · hr, 이었음. T_max은 시료 A, 시료 B 모두 1 hr으로 비슷함. C_max는 시료 A는 544.9 ng/ml, 시료 B는 912.3 ng/ml의 농도를 보임. 또한, 흰쥐에 cycloalliin 증대 마늘가공품을 cycloalliin 25 mg/kg의 농도로 경구투여 시 AUC0-24은 1652.3 ng/ml · hr, C_max는 257.4 ng/ml, T_max (hr)는 1 hr이었음.
ㅇ 식품 중 폴리페놀 신속 분석법 확립.
- 포도, 머루 : Dimethyl sulfoxide와 0.05M TBAQ, 2% HCl을 포함하는 메탄올을 이용하여 추출하고 이를 C18칼럼과 PDA가 장착된 초고속액체크로마토그래피 u-HPLC를 이용하여 delphinidin-3,5-O-diglucoside, delphinidin 등 10종을 분리하였음. 검출은 520 nm에서 실시
하였고 용매는 물과 아세토나이트릴를 사용하여 gradient system에서 분리하였음. 유효성검증 결과도 매우 양호함.
- 팥, 된장: 팥 및 된장에 적용한 추출방법에 따라 추출하여 이를 u-HPLC/PDA로 분리 정량함. 14종의 isoflavone을 동시분리 정량할 수 있는 방법을 확립함. 확립된 방법을 대두, 팥, 흑태 및 된장(전통식, 재래식) 등 5품목에 적용하여 추출방법 및 matrix effect를 검토하고, 검
량선의 직선성, LOD, LOQ, 반복성, 재현성 및 회수율에 대한 유효성검증을 실시한 결과 모두 국제적 수준에 적합한 것으로 나타냄.
- 메밀, 홍차, 돌미나리 : 효율적 추출을 위해 dimethyl sulfoxide를 가하고 다시 50% methanol 용액으로 추출한 후, 이를 u-HPLC/PDA를 기반으로 quercetin-3,4-O-diglucoside, myricetin-3-O-galatoside, Kaempferol-3-O-glucoside 등 11종의 flavonol glycoside를 동
시분리 정량할 수 있는 방법과 1% HCl로 가수분해 시킨 후 u-HPLC를 이용하여 myricetin, quercetin 등 4종의 flavonol aglycone을 메밀, 홍차, 돌미나리 등 3품목에 적용하여 추출방법 및 matrix effect를 검토하고, 검량선의 직선성, LOD, LOQ, 반복성, 재현성 및 회수율에 대한
유효성검증을 실시한 결과 모두 국제적 수준에 적합한 것으로 나타냄.
ㅇ 옻 가공식품 중 우루시올 이성체 분리 및 정량분석법 확립
- 옻칠액에서 고순도 우루시올 혼합용액의 제조를 위한 추출 및 정제방법 확립하여 개별 우루시올 이성체를 분리 분석할 수 있는 시험법 확립하여 정밀도 및 정확도를 측정한 결과 양호하였음.
- 추출 정제한 우루시올 혼합용액을 HPLC fraction collector로 우루시올 이성체의 분리조건을 확립하였고 분획된 우루시올 이성체를 GC/MSD 및 NMR을 이용하여 구조 동정 확인함.
- 옻이 첨가된 식품 및 옻 수액 등을 이용한 가공식품 7품목에 대해 유형별 옻 가공식품의 전처리 방법을 개발하고 GC/MSD를 이용한 우루시올 정량분석법을 확립하여 유효성 검증을 실시한 결과 국제적 기준에 적합한 것으로 나타남.
ㅇ 식품 유래 변종·신종 미생물의 분리·동정 분석법 확립
- 변종 장출혈성 대장균을 분석하기 위해 증균배지 및 선택배지를 비교하여 각각의 효율성을 분석하여 하여 최적을 분리 조건을 확립하였으며 multiplex PCR을 이용하여 대장균의 병원성 유전자의 신속 검출법을 확립하였음. Real time PCR을 이용하여 신속 검출방법을 확립하여 분석 시간을 단축하였으며 최적 시험 방법 모식도를 제시하였음.
- 장출혈성 대장균의 특성 분석을 위해 multiplex를 이용하여 혈청학적 유전자의 신속 검출법을 확립하였으며 rep-PCR을 이용하여 유전학적 특성 분석 방법을 확립하였음.
- 확립된 시험방법을 이용하여 비빔밥 및 식육에서 분리한 대장균에 적용하여 국내 유통중인 식품에서의 병원성 대장균의 위해 인자를 분석하였으며 식품에서 분리한 병원체 자원을 보유하였으며 시험 방법은 위해 미생물 분석을 통해 중소기업을 지원하고 있음.
- 식품 유래 신종 미생물인 Clostridium difficile의 분리 조건을 확립하기 위해 증균 배지, 발아 방법, 선택배지 등의 조건을 검토하여 식품에서 분리 조건을 확립하였음. 최적 분리 조건은 식품 5g을 CDMB 증균 배지에서 37도에서 7일 동안 배양 후에 에탄올로 발아 시킨 후 2차 증균 과정 후 CDMN 선택배지에서 배양하여 분리하는 분석 방법을 확립하였음.
- 확립한 방법으로 국내 유통 중 인 식육 415개에 대한 오염도 분석 결과 10.8%이 오염율을 나타냈음. 또한 분리한 균주에 독소 검사, 항생제 내성 조사, 유전자 지문 분석을 통한 병원성 위해 인자 발굴을 하였으며, 병원체 자원을 보유하였음.

Abstract ▼

Ⅳ Result
The rapid and precise analytical methods for determination of urushiols, microbial hazards and functional compounds in food were established using a chromatographic separation and PCR. The results can be summarized as followed;
ㅇ Development of analytical method for determination of

Ⅳ Result
The rapid and precise analytical methods for determination of urushiols, microbial hazards and functional compounds in food were established using a chromatographic separation and PCR. The results can be summarized as followed;
ㅇ Development of analytical method for determination of organosulfur compounds (OSCs)
- Macerated garlic oil: Analytical method for the quantification of organosulfur compounds(OSCs), including diallyl trisulfide, diallyl disulfide, 3-vinyl-4H-1,2-dithiin, 2-vinyl-4H-1,3-dithiin, Z-ajoene 및 E-ajoene in macerated garlic oil, was established
using a high performance liquid chromatograph (HPLC) with an PDA detector. These compounds were extracted with 40% ethyl acetate in hexane, followed by the sensitive and selective determination of all compounds in a single-run using a normal-phase HPLC. Further, the results of ajoene stability confirmed that the E-ajoene was very stable compound at the 4 ℃and10 ℃.
- Decomposition of allicin: Analytical method for the determination of decomposition of allicin including imethyl sulfide, allyl methyl sulfide, allyl methyl disulfide, diallyl sulfide, dimethyl trisulfide, diallyl dislfide, diallyl trisulfide 및 diallyl tetrasulfide in garlic oil was established using the reverse phase HPLC-UV system. This method was suitable for analysis of decomposition of allicin in garlic oil. Aforementioned all of the developed methods was validated based on FDA guideline for validation of analytical procedures, and we could obtain a satisfactory validation results on linearity, selectivity, detection limits, quantification limit, precision and accuracy. Further, the results of allicin stability confirmed that the allicin was very stable compound at the 4 ℃and-1 ℃.
- Trace functional compounds of garlic : The HPLC method for the determination of functional compounds of garlic including methiin and cycloalliin in fresh garlic, and the method was optimized and validated. Two OSCs were simply extracted with water, followed by the sensitive and selective determination of all compounds using a reverse-phase HPLC with fluorescence detection. The proposed method was performed based on the FDA guidelines for validation of analytical procedures. Factors affecting cycloalliin formation and the establishment of optimum condition for maximum production of cycloalliin: Factors affecting cycloalliin formation in processing procedures were evaluated. For the most efficient production of cycloalliin, the temperature was selected to establish the optimized condition for cycloalliin production. For this purpose, the response surface methodology was employed and the central composite design (CCD) was selected as the experimental design. The optimal condition for cycloalliin production was established.
ㅇ Development of analytical method for determination of metabolites in garlic and garlic products
- S-allyl-L-cysteine (SAC) and garlic products of increase SAC: Analytical method for the determination of metabolites of SAC and increased SAC products in rat plasma was established using the LC-MS/MS system. This method was suitable for analysis of metabolites of SAC in garlic. Aforementioned all of the developed methods was validated based on FDA guideline for validation of analytical procedures, and we could obtain a satisfactory validation results on linearity, selectivity, LOD, LOQ, precision and accuracy. The results of single oral dose SAC standard (12.5(A), 25(B) mg/kg), The AUC_0-6 from sample A was 1.2 ug/ml · hr and the AUC_0-6 from sample B was 17.6 ug/ml · hr and the AUC0-6 from sample C was 34.2 ug/ml · hr
- Diallyl disulfide (DADS) and garlic oil: Analytical method for the determination of metabolites of SAC in garlic was established using LLE preparation. This method was suitable for analysis of DADS and garlic oil in rat plasma. Aforementioned all of the developed methods was validated based on FDA guideline for validation of analytical procedures, and we could obtain a satisfactory validation results on linearity, selectivity, LOD, LOQ, precision and accuracy. The results of single oral dose SAC standard (20 (A), 50(B) mg/kg), The T_max from sample A and B were about 1hr and the C_max from sample A and B were 69.6 ng/mL and 70.4 ng/mL respectively.
- Cycloalliin and garlic products of increase cycloalliin: Analytical method for the determination of metabolites of and increased cycloalliin products in rat plasma was established using the LC-MS/MS system with removing the protein. Aforementioned all of the developed methods was validated based on FDA guideline for validation of analytical procedures, and we could obtain a satisfactory validation results on linearity, selectivity, LOD, LOQ, precision and accuracy. The results of single oral dose SAC standard (25(A), 50(B) mg/kg), The T_max from sample A and B were about 1hr and the C_max from sample A and B were 544.9 ng/ml and 912.3 ng/ml respectively.
ㅇ The rapid and precise analytical methods for the determination of anthocyanins, isoflavones and flavonol in foods using novel analytical method coupled u-HPLC were established. The results can be summarized as followed;
- The validation of the entire procedure was performed based on the ICH Q2B validation of analytical procedures: Methodology (1996) and Food and Drug Administration (FDA) guideline. The reliability of the method was satisfactory in terms of linearity (r > 0.99), precision (relative standard deviation below 20%), recovery (78.6%-111.8%).
- These results suggested that the rapid and accurate method used in this study could be available for the determination of anthocyanins, isoflavones and flavonol in various food samples and could be widely used as a tool for accurately identifying
qualities of food products in domestic market in Republic of Korea.
ㅇ Development of analytical method for determination of urushiol isomers in lacquer foods.
- The separating conditions of urushiol isomers using GC/MSD, HPLC fraction collector and NMR for the qualification were established.
- Urushiol isomers including C15:1, C15:2 and C15:3 in lacquer foods (lacquer tree extract, retort pouch lacquer, lacquer tee-bag, lacquer tree slice, lacquer sprout, lacquer chicken, lacquer duck) were separated and confirmed by GC/MSD.
- The validation of the entire procedure was performed based on the European Union directive 2002/657/EC and Food and Drug Administration (FDA) guideline. The reliability of the method was satisfactory in terms of linearity (r > 0.9927), precision
(relative standard deviation below 15%), recovery (80.7%-110.4%), and sensitivity.
ㅇ Development of detection method of new type and mutant bacteria in food matrix. The results can be summarized as followed;
- Performance comparison tests were carried out EC-MUG, BRILA-broth and mTSB enrichment broth on EHEC serogroups E.coli and other gram negative strains are compared. EC-MUG, 48h at 42°C is an effective medium for isolation EHEC. The
sensitiving and specificing of the 5 selective media was determined ENDO agar, chromocult agar, TBX agar, CHROMagar-STEC, CHROMagar-ECC. ENDO agar (80%) was found most efficient for the selection of strains belonging to major EHEC
serogroups but Serotype O121(20%) low efficiency so that ENDO and CHROMagar-STEC agar were combined with the detection of E.coli.
- E. coli were isolated from 113 of 396(28.5%) retailed meat investigated from 2013 to 2014 in Korea. Fifteen virulence genes specific for pathogenic E.coli Shiga toxin-producing (STEC), enteropathogenic (EPEC), enterotoxigenic (ETEC), nteroinvasive (EIEC) and enteroaggregative (EAEC) were examined. STEC virulence markers was detected eaeA(12.9%), escv(14.4%), ent(5.1%), hly(4.1%), stx1(3.7%), stx2(3.7%). EAEC virulence marker(astA) was detected in 24.8%. ETEC, EIEC were not detected. STEC serotypes were found O26(1.1%), but another serogroups such as O91, O103, O128, O157, O145, O111 and O121 were not found.
- C. difficile was to systematically assess multiple methods to determine the most sensitive method to recover C. difficile. The lower concentrations of were spiked meat specimens. Experiments were performed and each involved multiple combinations of untreated and treated specimens and selective broth and agar. In summary, the most sensitive method for the detection of C. difficile was ethanol treatment followed by inoculation in C. difficile moxalactam norfloxacin boullion(CDMN) within 7 days of incubation.
- C. difficile was isolated from 10.8% of retail raw meat samples. One isolated strain was toxigenic but O27 ribotype was not found.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 머리말 ... 3
• 요약문 ... 5
• Summary ... 9
• Contents ... 19
• 목차 ... 21
• 제1절 마늘 생리활성 지표물질 중 함황화합물 신속분석법 개발 ... 23
• 1. 서론 ... 23
• 2. Macerated garlic oil중의 기능성 황화합물 분석법 개발 ... 24
• 3. 마늘 중의 allicin 분해산물 분석법 개발 ... 32
• 4. 마늘 중의 미량기능성 성분 분석법 개발 ... 39
• 5. 요약 ... 48
• 참고문헌 ... 50
• 제2절 마늘가공품의 체내 대사체 분석법 개발 연구 ... 53
• 1. 서론 ... 53
• 2. SAC 표준품 및 SAC 증대 가공품의 체내 대사체 분석법 확립 ... 54
• 3. DADS 표준품 및 garlic oil 가공품의 체내 대사체 분석법 확립 ... 61
• 4. Cycloalliin 표준품 및 그 증대 가공품의 체내 대사체 분석법 확립 ... 69
• 5. 요 약 ... 79
• 참고문헌 ... 81
• 제3절 폴리페놀 분석법 개발 ... 82
• 1. 서론 ... 82
• 2. 과실류(포도, 머루) 중의 안토시아닌 분석법 개발 ... 82
• 3. 대두 및 된장 중의 이소플라본 분석법 개발 ... 88
• 4. 메밀, 홍차, 돌미나리 중의 플라보놀 어글리콘 및 글리코사이드 신속분석법 개발 ... 94
• 4. 요약 ... 104
• 참고문헌 ... 105
• 제4절 옻 가공식품 중 우루시올 및 이성체의 정밀분석법 개발 ... 106
• 1. 서론 ... 106
• 2. 우루시올 이성체 분리조건 확립 ... 106
• 3. HPLC-fraction collector를 이용한 분리분석 ... 109
• 4. 옻 가공식품의 우루시올 정량분석법 확립 및 유효성 검증 ... 116
• 5. 요약 ... 132
• 참고문헌 ... 134
• 제5절 식품 유래 변종·신종 미생물의 분리·동정 분석법 개발 ... 136
• 1. 서론 ... 136
• 2. 변종 미생물(EHEC)의 검출법 확립 및 병인학적 특성 조사 ... 137
• 3. 신종 미생물 (Clostridium difficile)의 검출법 확립 및 특성 조사 ... 153
• 4. 요약 ... 172
• 참고문헌 ... 173
• 끝페이지 ... 175