초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
비소세포폐암 세포주인 NCI-H460, NCI-H1299, A549 세포에 autophagy를 유도하는 mTOR inhibitor인 rapamycin, temsirolimus, everolimus 등과 Akt inhibitor인 GSK690693, HDAC inhibitor인 SAHA (vorinostat) 등을 투여하고 세포 생존률에 미치는 영향을 조사하였다. 세 종류의 세포에서 모두 비슷한 양상을 보였으며, 민감도가 아주 높지는 않지만 약 50μM 정도까지 투여하였을때, 거의 모든 세포가 사멸하였다. 이러

Ⅳ. 연구개발결과
비소세포폐암 세포주인 NCI-H460, NCI-H1299, A549 세포에 autophagy를 유도하는 mTOR inhibitor인 rapamycin, temsirolimus, everolimus 등과 Akt inhibitor인 GSK690693, HDAC inhibitor인 SAHA (vorinostat) 등을 투여하고 세포 생존률에 미치는 영향을 조사하였다. 세 종류의 세포에서 모두 비슷한 양상을 보였으며, 민감도가 아주 높지는 않지만 약 50μM 정도까지 투여하였을때, 거의 모든 세포가 사멸하였다. 이러한 과정에서 autophagy가 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, K-RAS 돌연변이 비소세포폐암 세포주에서 RAS 경로와 PI3K 경로를 autophagy 조절 약제인 MEK 억제제와 mTOR 억제제를 이용하여 동시에 억제하였을 때 어떠한 효과가 나타나는지를 살펴보았다. 두 경로를 동시에 억제함으로써 세포사멸의 상승효과를 얻을 수 있었으며, 이것은 미토콘드리아 경로에 의한 apoptosis의 증가보다는 death receptor 경로를 통한 apoptosis의 증가에 의한 것으로 생각되었다.
NCI-H460 세포에 temsirolimus, GSK690693 혹은 autophagy 억제제인 hydroxychloroquine 등을 투여하고 방사선을 조사한 후 clonogenic assay를 시행하여 방사선 효과를 분석하였다. 이들 약제를 투여하고 ionizing radiation을 시행하면 ionizing radiation만 시행한 경우에 비해 survival fraction이 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 autophagy 조절 약제가 radiosensitizer로서 작용할 수 있음을 시사하는 소견이다. 또한, 비소세포폐암 세포주인 A549, NCI-H460 세포에서 autophagy를 조절하는 한편 방사선 내성기전으로 알려져 있는 PI3K 경로와 RAS 경로의 억제가 방사선 감수성에 미치는 영향을 조사하였다. PI3K 또는 RAS 경로를 억제함으로써 방사선감수성이 증가하였으며, 두 약제를 동시에 처리한 경우 더욱 증가하였다. 이는 DNA repair의 지연, G2/M arrest의 유지, apoptosis의 증가와 관련되어 있었다.
EGFR tyrosine kinase inhibitor에 저항을 보이는 T790M 돌연변이를 가지고 있는 세포에 비가역적 EGFR TKI들과 autophagy 조절과 관련되어 있음이 알려져 있는 HDAC 억제제를 병합 투여하였을 때 autophagy가 강하게 유도되며, apoptosis의 증가 뿐 아니라 autophagic cell death로 인해 세포사멸이 증가함을 확인하였다. 또한, PTEN에 대한 shRNA를 포함한 lentiviral vector를 이용하여 PTEN을 knock-down 시킨 NCI-H827 세포에 autophagy를 유도하는 rapamycin, everolimus 등을 투여한 후 ionizing radiation을 시행하고 그 효과를 관찰하였다. PTEN knock-down 자체에 의해 방사선 내성이 유도되는 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 내성이 rapamycin, everolimus 투여에 의해 극복되는 것을 확인할 수 있었다. 이 과정에서 autophagy를 억제하면 방사선 내성이 재발되었다.
Autophagy 유도제로 확인된 Akt 억제제의 효과에 대한 예측 인자로서, Akt1의 활성화 mutation인 E17K mutation을 조사해 보았다. Akt 억제제에 민감한 7례의 비소세포폐암 세포주를 대상으로 검사해 보았으나 E17K mutation이 관찰되지 않았다. 또한, 수만 개의 유전자 발현 양상을 한 번에 확인할 수 있는 microarray 기법을 이용하여, 약제 저항성을 가진 EGFR T790M 비소세포폐암세포주에서 autophagy 관련 유전자를 포함한 중요 유전자들의 발현 변화를 확인하였다. Gene ontology 분석을 통해 내성주에서 특이적으로 발현 변화가 나타난 세포 생존 및 사멸에 관련된 유전자들을 확인하였다. 이는 내성주 극복을 위한 새로운 타겟 유전자의 탐색 및 내성 매커니즘을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼

Autophagy is a self-catabolic process that maintains intracellular homeostasis and prolongs cell survival under stress via lysosomal degradation of cytoplasmic constituents and recycling of amino acids and energy. Autophagy is intricately involved in many aspects of human diseases, including cancer.

Autophagy is a self-catabolic process that maintains intracellular homeostasis and prolongs cell survival under stress via lysosomal degradation of cytoplasmic constituents and recycling of amino acids and energy. Autophagy is intricately involved in many aspects of human diseases, including cancer. Autophagy is a double-edged sword in tumorigenesis, acting both as a tumor suppressor and a protector of cancer cell survival. Better understanding of autophagy regulation and its impact on treatment outcome will potentially allow us to identify novel therapeutic targets for radiation and chemotherapy in lung cancer.
In the present study, we have tested whether modulation of autophagy has effect on survival of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells and evaluated combination effect of autophagy-modulating drugs and radiation. We also tested new possible therapeutic regimens including combination of autophagy-modulating agents and proapoptotic drugs. In addition, we are intended to find biomarkers to predict responsiveness to these new therapies.
Autophagy induction with various agents including mTOR inhibitors, Akt inhibitors, and HDAC inhibitors caused cell death in lung cancer cells. Combinaton treatment with these agent significantly enhanced the anti-cancer effect in chemo-sensitive or resistant cells. Autophagy induction or inhibition sensitized lung cancer cells to radiation. During this process, autophagy had a critical role. When we treated EGFR tyrosine kinase-resistant cells with both an autophagy inducer and an irreversible EGFR tyrosine kinase inhibitor, cell death increased significantly in a synergistic manner. PTEN-knock downed lung cancer cells, having radioresistance, became radiosensitized by autophagy induction with mTOR inhibitors. Further, microarray analysis gave us large amount of genetic data for biomarker studies.
In conclusion, autophagy modulating agents resulted in increased cell death of NSCLC cells and this might be the rationale for combination treatment of these drugs for lung cancer treatment.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 5
• CONTENTS ... 7
• 목차 ... 8
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 9
• 제 1 절 연구의 필요성 ... 9
• 제 2 절 연구 목표 ... 13
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 14
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 15
• 제 1 절 폐암에서 Autophagy 조절 약제의 효과와 그 기전에 대한 연구 ... 16
• 제 2 절 폐암 방사선 치료에서 Autophagy 조절 약제의 Radiosensitizer 효과에 대한 연구 ... 19
• 제 3 절 폐암에서 Apoptosis 유발 항암제와 Autophagy 조절 약제의 병합치료 효과에 대한 연구 ... 23
• 제 4 절 PTEN 발현 저하에 의한 EGFR-TKI 내성 폐암세포에서 Autophagy를 유발하는 mTOR 억제제의 항암효과 및 Radiosensitizer로서의 효과에 대한 연구 ... 27
• 제 5 절 Autophagy 조절 약제의 효과에 대한 예측인자와 Biomarker 연구 ... 28
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 33
• 제 1 절 목표달성도 ... 33
• 제 2 절 관련분야에의 기여도 ... 33
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 33
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 34
• 제 7 장 참고문헌 ... 35
• 끝페이지 ... 36