[보고서]콩 생산성 향상을 위한 비생물적 스트레스 저항성 관련 신규 유용 유전자 발굴 및 기작 분석

콩 생산성 향상을 위한 비생물적 스트레스 저항성 관련 신규 유용 유전자 발굴 및 기작 분석
Isolation and functional analyses of novel genes involved in resistance to abiotic stress for improved soybean productivity 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	동아대학교 Donga University
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2015-02
과제시작연도	2014
주관부처	농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
과제관리전문기관	농촌진흥청 Rural Development Administration
등록번호	TRKO201500010154
과제고유번호	1395035379
사업명	차세대바이오그린21
DB 구축일자	2015-07-11
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201500010154

초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
○ 콩과 녹두의 EST database를 검색하여 비생물적 스트레스 관련 유전자를 선별하고 여러 가지 스트레스 처리에 대한 유전자 발현 분석을 수행한다.
○ 유용 유전자의 Full-length cDNA를 분리하여 GFP 벡터에 클로닝하여 세포내 위치를 분석하며, 대장균, 효모 발현 벡터에 유전자를 클로닝하여 삼투 스트레스에 저항성이 증진하는지를 분석하여 유전자 기능을 연구한다. Yeast 2-hybrid 시스템을 이용하여 단백질 상호작용을 연구한다.
○ 콩 및 녹두 유래 유용 유전자를 식물 과다발현

Abstract ▼

Abiotic stresses are the major concern in recent years as their effect on world food production is constantly increasing. We have obtained salt tolerant Arabidopsis lines overexpressing SaRBP1 (Suaeda asparagoides RNA binding protein 1) of a Korean halophyte, S. asparagoides. Homozygous T3 Arabidopsis transgenic lines were developed and used for salt stress tolerance studies. The transgenic seedlings displayed tolerance to salt and mannitol compared to the wild type (WT) seedlings. Transgenic lines produced longer primary roots, more fresh weight, and higher number of lateral roots than WT. In planta stress tolerance assay results showed that the survival rates of transgenic plants were significantly higher than WT plants. Transgenic lines showed delayed germination under 200 mM NaCl stress. In addition, the transgenics showed higher water retention ability than WT. Subcellular localization results revealed that SaRBP1 was targeted to the cytoplasm. Northwestern blot analysis results confirmed the RNA binding property of SaRBP1. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction results revealed that many stress marker genes were upregulated by SaRBP1 overexpression. Thus, our data demonstrate that SaRBP1 overexpression lines are tolerant to salt stress. Hence, this is the first report for the functional characterization of SaRBP1, a novel RBP gene isolated from S. asparagoides cDNA library.

목차 Contents

완결과제 최종보고서 ... 1
제출문 ... 2
요약문 ... 3
SUMMARY ... 5
목 차 ... 6
제 1 장 서 론 ... 7
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 8
제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 9
제 4 장 연구개발 목표 달성도 및 대외 기여도 ... 45
1. 세부과제별 정성적 연구목표대비 달성도 ... 46
2. 정량적 목표대비 달성도 ... 47
제 5 장 연구개발 결과의 활용계획 ... 48
제 6 장 연구개발 과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 49
제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 49
제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 49
제 9 장 참고문헌 ... 49
끝페이지 ... 51

표/그림 (32)

표 비생물적 스트레스에 특이적 유도되는 콩 TFs에 대한 연구 결과.
표 Real-time (q)RT-PCR 분석을 이용한 콩 C3H ZF 유전자 발현 분석. 4주된 콩 에 저온(4°C), ABA(100 μM), NaCl(100 mM), 가뭄(Drought) 스트레스를 24시간까지 처 리하여 RNA를 분리하여, cDNA 합성한 후 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 real-time RT-PCR을 수행한 결과.
표 콩 C3H 도메인을 나타내는 그림. C3H는 RNA recognition, ankyrin, C3H-type zinc finger, coiled coil region을 포함하고 있으며, 여러 deletion construct를 보여준다.
표 콩 GFP-C3H의 식물 세포내 위치 분석. 공촛점 현미경을 이용한 원형질체에서 콩 GFP-C3H 세포내 위치 분석. Green, GFP channel; Red, chlorophyll channel; Merged, merged channel; Light, light channel.
표 C3H 과다발현 애기장대 식물체 발아율 분석. WT과 과다발현 식물체 종자를 mannitol(300 mM)이나 ABA(0.8 μM) 첨가 배지에 발아시켜 발아율을 측정한 그래프. 3 반복씩 실험측정치의 평균을 계산하여 그래프 결과.
표 C3H ZF 과다발현 애기장대 식물체 가뭄 저항성 분석. 4주된 WT과 과다발현 식물체를 가뭄 스트레스를 처리한 후 물을 주어 생존율을 분석한 결과.
표 Real-time (q)RT-PCR 분석을 이용한 콩 NAC TF 유전자 발현 분석. 4주된 콩 에 저온(4°C), ABA(100 μM), NaCl(100 mM), 가뭄(Drought) 스트레스를 24시간까지 처 리하여 RNA를 분리하여, cDNA 합성한 후 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 real-time RT-PCR을 수행한 결과.
표 콩 GFP-NAC의 식물 세포내 위치 분석. 공촛점 현미경을 이용한 담배 표피조직 에서 콩 GFP-NAC의 세포내 위치 분석. Green, GFP channel; Red, chlorophyll channel; Merged, merged channel; Light, light channel.
표 효모의 GAL4 시스템을 이용하여 콩의 NAC의 전사활성 능력 분석. (A) 콩 NAC 단백질 구조. DNA binding domain인 NAC 도메인과 전사활성조절 도메인으로 크게 나 뉜다. (B) GAL4 DBD와 NAC 융합 construct를 효모에 발현시킨 후 아미노산 결핍 배 지에 키운 사진. (C) NAC 전사활성을 조사하기 위해 β-galactosidase 활성을 보여주는 분석 그래프. P/C, positive control; N/C, negative control.
표 NAC 과다발현 애기장대 식물체 분석. RT-PCR을 이용하여 과다발현 형질전환체 유전자 발현 분석.
표 NAC 과다발현 애기장대 식물체 스트레스 저항성 분석. MS에 발아시킨 후 10 일째 WT과 과다발현 식물체 유묘를 mannitol(200, 300 mM)이나 NaCl(100, 150 mM) 를 포함하는 배지에 옮긴 후 10일 후에 찍은 사진.
표 NAC TF 과다발현 애기장대 식물체 가뭄 저항성 분석. 4주된 WT과 과다발현 식물체를 가뭄 스트레스를 처리한 후 물을 주어 생존율을 분석한 결과.
표 NAC49 과다발현 애기장대 식물체 분석. (A) MS에 발아시킨 후 10일째 WT과 과다발현 식물체 유묘를 MS, mannitol(200, 300 mM)이나 NaCl(100, 150 mM)를 포함 하는 MS 배지에 옮긴 후 10일 후에 뿌리길이를 측정하여 얻은 값이다. (B) WT과 과다 발현 식물체 종자를 mannitol(300 mM)이나 ABA(0.8 μM) 첨가 배지에 발아시켜 발아율 을 측정한 그래프. 3반복씩 실험측정치의 평균을 계산하여 그래프를 분석.
표 NAC49 TF 과다발현 애기장대 식물체 가뭄 저항성 분석. (A) 식물체 잎의 떼 어 공기중에 노출시켜 20분 간격으로 수분 손실율을 계산한 그래프. (B) 4주된 WT과 과 다발현 식물체를 가뭄 스트레스를 처리한 후 물을 주어 생존율을 분석한 결과.
표 WT과 NAC49 과다발현 식물에서 ABA와 drought stress(DR)에 의해 스트레 스 마커 유전자 발현량 비교. 스트레스 없는 control(C), ABA(100 μM) 3시간 처리, 2주 간 가뭄 스트레스(DR)를 처리한 잎의 total RNA를 추출한 후 cDNA 합성하고 난 후 각 유전자에 해당하는 프라이머로 PCR 증폭한 산물을 아가로즈젤에 전기영동한 후 EtBr로 염색한 사진.
표 Real-time (q)RT-PCR 분석을 이용한 콩 WRKY TF 유전자 발현 분석. 4주된 콩에 저온(4°C), ABA(100 μM), NaCl(100 mM), 가뭄(Drought) 스트레스를 24시간까지 처리하여 RNA를 분리하여, cDNA 합성한 후 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 real-time RT-PCR을 수행한 결과.
표 효모의 GAL4 시스템을 이용하여 콩의 WRKY의 전사활성 능력 분석. (A) 콩 WRKY 도메인 분석을 위하여 전체(Full, F), 아미노 터미널(N-terminal, N), 중간 (Middle, M), 카르복시 터미널(C-terminal, C) 부분을 GAL4 DB와 융합된 construct를 효모에 발현시킨 후 아미노산 결핍 배지에 키운 사진. (B) WRKY 전사활성을 조사하기 위해 β-galactosidase 활성을 보여주는 분석 그래프. P/C, positive control; N/C, negative control.
표 콩 GFP-WRKY의 식물 세포내 위치 분석. (A) 공촛점 현미경을 이용한 담배 표피조직에서 콩 GFP-WRKY의 세포내 위치 분석. (B) 공촛점 현미경을 이용한 원형질체 에서 콩 GFP-WRKY의 세포내 위치 분석. Green, GFP channel; Red, chlorophyll channel; Merged, merged channel; Light, light channel.
표 WRKY 과다발현 애기장대 식물체 분석. genomic PCR과 RT-PCR을 이용하여 과다발현 형질전환체 유전자 발현 분석.
표 WRKY 과다발현 애기장대 식물체 발아율 분석. WT과 과다발현 식물체 종자를 mannitol(300 mM)이나 ABA(0.8 μM) 첨가 배지에 발아시켜 발아율을 측정한 그래프. 3 반복씩 실험측정치의 평균을 계산하여 그래프를 분석.
표 WRKY TF 과다발현 애기장대 식물체 가뭄 저항성 분석. (A, B) 4주된 WT과 과다발현 식물체를 가뭄 스트레스를 처리한 후 물을 주어 생존율을 분석한 결과. (C) 식 물체 잎의 떼어 공기중에 노출시켜 20분 간격으로 수분 손실율을 계산한 그래프.
표 Hsf A와 B 타입 모식도와 효모의 GAL4 시스템을 이용하여 콩의 Hsf의 전사 활성 능력 분석. (A) 콩 Hsf 단백질 구조 분석. (B) 효모의 GAL4 시스템을 이용한 콩 Hsf 전사활성 분석.
표 삼투 스트레스 배지 조건하에 HSF28 과다발현 애기장대 식물체 뿌리 발달과 발아율 분석. (A) MS 배지에 발아시킨 10일 된 유묘를 mannitol, 또는 NaCl이 첨가된 배지에 옮겨 10일 동안 키운 후 뿌리 길이를 분석한 그래프 (B) WT과 과다발현 식물체 종자를 mannitol(300 mM)이나 ABA(0.8 μM) 첨가 배지에 발아시켜 발아율을 측정한 그 래프. 3반복씩 실험측정치의 평균을 계산하여 그래프를 분석.
표 Hsf28 과다발현 애기장대 식물체 고온 스트레스 저항성 분석. (A) 10일된 WT, hsp101 과 과다발현 식물체를 44°C, 40분간 고온 스트레스를 처리한 후 7일째 찍은 사진. (B) 4주된 WT과 과다발현 식물체에 45°C, 2시간 고온 스트레스를 처리한 후 이 온 누출율을 측정한 그래프. 3반복씩 실험측정치의 평균을 계산하여 그래프를 분석.
표 WT과 Hsf28 과다발현 식물에서 고온 스트레스(45°C, 2시간) 후 스트레스 마커 유전자 발현량 비교. (A) 스트레스 없는 control(C), 고온 스트레스 처리한 잎의 total RNA를 추출한 후 cDNA 합성하고 난 후 각 유전자에 해당하는 프라이머로 PCR 증폭한 산물을 아가로즈젤에 전기영동한 후 EtBr로 염색한 사진. (B) Real-time (q)RT-PCR 분 석을 이용한 Hsf28 과다발현에 의한 마커 유전자 발현 분석. 4주된 애기장대에 고온 스트레스 처리한 후 12 시간에 잎의 total RNA를 추출한 후 cDNA 합성하고 난 후 각 유 전자에 해당하는 프라이머로 24시간까지 처리하여 RNA를 분리하여, cDNA 합성한 후 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 real-time RT-PCR을 수행한 결과.
표 Clustering 분석 결과의 Heatmap & Line plot. (A) Heatmap은 왼쪽부터 Control_vs_Cold, Control_vs_Drought, Control_vs_Heat, Control_vs_Salt 데이터 표 현. (B) Line Plot은 heatmap에 표현된 cluster를 패턴으로 표현.
표 Real-time (q)RT-PCR 분석을 이용한 6개 클러스터에 속한 콩 유전자 발현 분 석. 4주된 콩에 저온(4°C), 고온(45°C), NaCl(100 mM), 가뭄(Drought) 스트레스를 3시간 처리하여 RNA를 분리하여, cDNA 합성한 후 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 real-time RT-PCR을 수행한 결과.
표 과다발현 콩 형질전환 식물체 생산. (A) 35S:RsERF1 construct. (B) RsERF1 과다발현 콩 형질전환체의 유전자 도입 확인을 하기 위한 genomic DNA PCR 분석 사 진. (C) RsERF1 과다발현 확인을 하기 위한 RT-PCR 분석 사진. Bar, basta gene primer.
표 RsERF1 과다발현 콩 형질전환 식물체 염분 스트레스 저항성 분석. (A) 염분 스트레스 처리 후 WT 콩과 형질전환체 식물 사진. (B) 염분 스트레스 처리 전, 후 수분 함량 분석 그래프. (C) 염분 스트레스 처리 전, 후 엽록소 함량 분석 그래프.
표 염분 스트레스 배지 조건하에 RsERF1 과다발현 콩 발아 분석. MS 배지, NaCl이 첨가된 배지에 콩을 발아시켜 7일 후 찍은 사진.
표 과다발현 콩 형질전환 식물체 생산. (A) 35S:GmHsf12 construct. (B) GmHsf12 과다발현 콩 형질전환체의 유전자 도입 확인을 하기 위한 genomic DNA PCR 분석 사진. (C) GmHsf12 과다발현 확인을 하기 위한 RT-PCR 분석 사진. Bar, basta gene primer.
표 염분 스트레스 배지 조건하에 GmHsf12 과다발현 콩 발아 분석. MS 배지, NaCl이 첨가된 배지에 콩을 발아시켜 7일 후 찍은 사진.

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